Кп шаблон: Attention Required! | Cloudflare

Первичный интерфейс плагина — это дополнительная вкладка, которая отображается в основной форме добавления записи.По умолчанию идет вкладка в новой записи представит вам одну из двух кнопок, «Инициализировать как шаблон» или «Установить родительский шаблон». Появляется «Init As Template» если он находится в группе шаблонов для базы данных.

«Инициализировать как шаблон» отмечает запись как шаблон и показывает конструктор графического интерфейса пользователя. интерфейс на вкладке. Это таблица с 4 столбцами: «Заголовок», «Поле», «Имя поля» и «Тип». «Заголовок» — это заголовок, который будет отображается пользователю для объяснения поля. «Поле» — это либо одно из поля по умолчанию для записи (заголовок, имя пользователя, пароль, срок действия и т. д.) или Custom для стандартного дополнительного строкового поля. «Имя поля» — это фактическое имя поля, оно должно быть уникальным (как и строковые поля) и является фактическим именем поля, под которым оно хранится. Наконец, «Тип» — это то, как поле отображается для пользователя, у него много опций, большинство из которых не требуют пояснений. Некоторым может потребоваться пояснение:

• «Inline» — стандартное текстовое поле

• «Rich Textbox» — это расширенное текстовое поле (выделение URL-адресов и тому подобное, как в обычном поле для заметок).

• «Всплывающее окно» показывает стандартное окно редактирования настраиваемого поля.

• «Разделитель» вообще не является полем, а может использоваться для разделения GUI для пользователя

Если тип начинается со слова «Защищено», это означает, что он находится в памяти. зашифрованный. Обратите внимание, что «Имя поля» и «Тип» нельзя изменить, кроме пользовательские записи. Строки можно удалить, выбрав заголовок строки (поле на слева) и щелкнув Удалить. Порядок строк можно изменить, перетащив строку по заголовку.

После настройки шаблона вы можете создать дочерний элемент. Создать запись в любом месте, кроме папки шаблонов, и когда вы переходите в На вкладке «Шаблон» вы увидите «Установить родительский шаблон». Щелкните здесь и выберите шаблон, который вы только что создали. Как только вы это сделаете, вы увидите созданный вами графический интерфейс. объявиться. Теперь он будет отображать этот графический интерфейс по умолчанию, когда вы откроете запись, которая вы устанавливаете родителя на. Редактирование полей в графическом интерфейсе имеет тот же эффект. как редактирование их вручную, поэтому вам не нужно использовать графический интерфейс.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ GUI

• Если вы добавите «Подтвердить поле» в свой графический интерфейс, он покажет пароль генератор и убедитесь, что подтвержденный пароль совпадает с паролем перед тем, как разрешить пользователю сохранить (то же самое, что и при редактировании основной записи). Обратите внимание, что в шаблоне всегда должно быть поле «Пароль», если вы есть поле «Подтвердить», иначе подтверждение будет бесполезно.

• При нажатии раскрывающегося списка в главном меню для создания нового шаблона на основе записи, если этот шаблон является шаблоном графического интерфейса, он автоматически удалит все строки шаблона графического интерфейса пользователя из него и сделать новую запись правильным дочерним элементом из этого.

• Некоторые типы (встроенные поля и списки) могут иметь параметры, щелкните значок Кнопка выбора в построителе графического интерфейса пользователя, чтобы установить параметры для элемента.

• В контекстное меню, вызываемое щелчком правой кнопкой мыши, были добавлены две опции для записей. Для всех записей (включая сразу несколько) вы можете нажать «Установить родительский шаблон», чтобы назначить шаблон в качестве родительского. Во-вторых, на записи, у которых уже есть родительский шаблон, есть Подменю «Копировать строку шаблона», которое позволяет копировать любую из строк. в буфер обмена, это очень похоже на подпрограмму «Копировать настраиваемую строку» меню, но позволяет делать это по заголовку шаблона, а не по имя поля.

ВАЖНЫЕ ПРИМЕЧАНИЯ

Плагин полагается на то, что вы установили группу шаблонов для базы данных, поэтому обязательно сделайте это и сохраните свои шаблоны в этой папке.

Плагин сохраняет все настройки графического интерфейса шаблона в самой записи шаблона (в дополнительные поля) их можно удалить, нажав «Удалить как шаблон». Единственное другое изменение, которое вносит подключаемый модуль, касается записей, которые являются дочерними для в шаблоне у них есть 1 дополнительное поле (можно удалить, щелкнув Удалить как Дочерний шаблон) нет внешних данных или сохраненных конфигураций.Имея в виду вам не нужно копировать настройки или дополнительные файлы, если вы копируете свой храните базу данных на другом компьютере и установив плагин, он будет просто работайте, как на вашем последнем компьютере.

ЗНАЧЕНИЯ ПО УМОЛЧАНИЮ

Чтобы сохранить значения по умолчанию внутри шаблона, нужно знать небольшую хитрость: имя вашего поля на вкладке Template должно совпадать с именем строкового поля («Имя поля» в основном графическом интерфейсе). Т.е. каждое поле, для которого устанавливается значение по умолчанию, должно иметь соответствующее поле на вкладке Advanced , заполненное каким-либо значением, чтобы присвоить ему значение по умолчанию.

УСТАНОВКА

• Скачать с https://github.com/mitchcapper/KPEntryTemplates/releases

• Распакуйте плагин (KPEntryTemplates.plgx) и поместите в KeePass. программный каталог

• Запустите KeePass и откройте базу данных

• В KeePass нажмите «Редактировать> Добавить группу» и назовите его примерно так «Шаблоны», нажмите Enter, чтобы завершить добавление новой группы.

• Выберите «Файл»> «Настройки базы данных»… «и выберите вкладку» Дополнительно «.

• В наборе групп «Шаблоны» установите «Группа шаблонов ввода:» выберите группу, которую вы только что создали, и нажмите «ОК». Это закроет базу данных диалоговое окно настроек и вернет вас к основному приложению.

• В главном приложении выберите папку «Шаблоны» и нажмите «Правка> Добавить запись …»

• В диалоговом окне «Добавить запись» выберите вкладку «Шаблон» и щелкните «Инициализировать как шаблон»

• Создайте новый шаблон, добавив любые поля по вашему желанию

• Обязательно переключитесь обратно на вкладку «Запись» и введите имя шаблон в поле «Заголовок».

• Если вас устраивает, нажмите «ОК», чтобы сохранить шаблон.

• Ваш шаблон теперь готов к использованию при добавлении или редактировании записей

Объединение шаблонов CRISPR / Cas9 и rAAV для эффективного редактирования генов

Nucleic Acid Ther. 2015 Dec 1; 25 (6): 287–296.

Кафедра клеточной и молекулярной медицины, Калифорнийский университет, Сан-Диего, Ла-Хойя, Калифорния.

^* Текущая принадлежность: Институт биохимии II, Медицинский факультет Университета Гете, Франкфурт-на-Майне, Германия.

Поступила в редакцию 20 апреля 2015 г .; Принята к печати 28 сентября 2015 г.

Abstract

Изменение эндогенных генов в клетках — неотъемлемый инструмент современной клеточной биологии.Простота использования системы CRISPR / Cas9 для введения разрывов геномной ДНК в определенных сайтах in vivo привела к ее быстрому и широкому внедрению. В отсутствие ДНК-матрицы повреждение восстанавливается за счет негомологичного соединения концов, которое разрешается как внутренние делеции. Однако в присутствии гомологичной матрицы ДНК гомологически направленная репарация происходит с различной эффективностью. Недавняя работа продемонстрировала, что высокоэффективное нацеливание на гены может быть вызвано сочетанием нацеливания CRISPR / Cas9 на геномные локусы с рекомбинантным аденоассоциированным вирусом (rAAV) для обеспечения одноцепочечной гомологичной матрицы ДНК.Здесь мы рассматриваем текущее состояние редактирования генов на основе CRISPR / Cas и даем практическое руководство по применению системы CRISPR / Cas и rAAV для высокоэффективного, экономичного и эффективного нацеливания на гены.

Краткая история редактирования генов и биологии CRISPR

В 1979 году Шерер и Дэвис положили начало генетике дрожжей, продемонстрировав, что последовательности вектора, генерируемые in vitro , могут вызывать гомологически направленную рекомбинацию в Saccharomyces cerevisiae для удаления или изменения любой изолированный ген [1].Вскоре после этого процесс редактирования генома был использован в клетках человека [2–4]. Десять лет спустя было сделано открытие, что геномные разрывы могут быть исправлены либо негомологичным соединением концов (NHEJ), либо гомологически направленной репарацией (HDR), причем HDR является процессом, необходимым для точного или шаблонного редактирования генома [5–9]. Примерно в то же время были открыты нуклеазы цинковых пальцев [10–12] и продемонстрирована их способность к целенаправленному редактированию генома [13–15]. В 2009 году были расшифрованы эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN) из патогена растений Xanthomonas [16–18], что сделало возможным дизайн in silico и предсказания связывания для TALEN.Благодаря их простоте и дизайну in silico многие лаборатории использовали сконструированные TALEN для своих стратегий редактирования генома.

Параллельно с областью редактирования генов, молекулярная биология CRISPR (сгруппированные с регулярными интервалами короткие палиндромные повторы) открыла совершенно новые возможности редактирования генома. Вскоре после их первоначального описания в конце 1980-х годов Ишино и др. [19], было установлено, что эти последовательности состоят из вирусных нуклеотидных последовательностей и имеют рядом CRISPR-ассоциированные ( cas ) гены [20–27].Эта работа привела к гипотезе о том, что CRISPR / Cas является бактериальной иммунной системой [26,28]. В течение следующих лет были определены молекулярные механизмы и идентифицирована система CRISPR / Cas типа II, которая разрезает ДНК программируемым и специфичным для последовательности образом [29]. Идентификация транс--активирующих crispr РНК (tracrRNAs) и их участие в созревании crRNA с помощью RNase III закрыли разрыв между отсутствующими эндорибонуклеазами и созреванием crRNAs [30]. До этого все системы CRISPR / Cas считались мультибелковыми / РНК-системами, которые было трудно собрать in vitro .Однако в 2011 году работа Sapranauskas et al. [31] и Jinek et al. [32] продемонстрировал, что одного гена cas (Cas9) достаточно для полностью функциональной системы защиты типа II и что Cas9 является РНК-управляемой ДНК-эндонуклеазой [33], соответственно.

Использование CRISPR / Cas для редактирования генов, специфичных для последовательности, с тех пор было продемонстрировано на различных типах клеток и тканях эукариот [34–37]. Простота этой технологии продемонстрирована большим количеством научной литературы за последние 2 года, которая включает описание нецелевых мутагенных эффектов [38-40], улучшенный дизайн однонаправленной РНК (sgRNA) [41-43], активация или репрессия эндогенных генов [44,45], развитие никаз Cas9 или слитых белков dCas9-FokI [46–49], нокаутных библиотек по всему геному [50–53], мышей с нокаутом CRISPR / Cas9 [54,55] и мутации генов у живого животного [56–58].Взятые вместе, эти недавние быстрые успехи в нашем понимании системы CRISPR / Cas9 свидетельствуют о ее ярком потенциале для генной терапии и использования для открытия новых генетических путей, управляющих биологией клетки.

Выбор «правильного» Cas9 для каждого приложения

Системы CRISPR / Cas можно в целом разделить на три конкретных типа (I – III) на основе комбинации белков Cas, присутствующих в геноме соответствующего организма [59]. Обычно используемая система типа II характеризуется своим единственным рибонуклеопротеидным комплексом CRISPR (Cas9), в то время как типы I и III представляют собой мультибелковые комплексы, содержащие множество различных субъединиц Cas.Интересно, что типы I и II нацелены на ДНК, в то время как тип III эволюционировал для целевой РНК [59,60]. Тот факт, что системы типа II содержат единственный ген Cas, сделал их идеальными для множества приложений, в первую очередь для геномной инженерии с целью создания моделей «болезнь в чашке», создания моделей на животных и разработки лекарств [61].

Рибонуклеопротеин типа II (Cas9) представляет собой мультидоменную РНК-управляемую ДНК-эндонуклеазу с двумя каталитическими центрами, HNH и RuvC [32,62]. Особое значение имеют два аминокислотных остатка: D10 (домен RuvC) и H840 (домен HNH).Мутация любого остатка в аланин превращает Cas9 в фермент никазу только с одним активным каталитическим центром [47,48] (). Мутация обоих остатков будет генерировать фермент Cas9 без ДНК-нуклеазной активности, сохраняя при этом его способность избирательно связывать ДНК управляемым РНК образом.

Доступные виды Cas9 и их применения. Выделены соседний мотив протоспейсера (PAM), два домена нуклеазы Cas9, RuvC и HNH, и положение ДНК ( стрелка, ), на которое они действуют, а также положение однонаправляющей РНК (sgRNA).Фермент дикого типа, опосредованный двумя нуклеазными доменами, генерирует двухцепочечный разрыв ДНК. Мутация одного нуклеазного домена в D10A или H840A приведет к образованию фермента никазы, который способен разрезать ДНК только на сайт-мишень sgRNA. Ферменты никазы можно использовать в паре для повышения специфичности и уменьшения побочных эффектов. Мутация обоих нуклеазных доменов приводит к каталитически «мертвому» ферменту (dCas9), который сохраняет способность связывать ДНК, управляемую РНК. Комбинирование dCas9 либо с Cas9-связанными, либо с sgRNA-связанными эффекторными доменами можно использовать для активации транскрипции, репрессии или геномной визуализации.

Cas9 дикого типа можно использовать в качестве отдельного фермента для генерации индел, вставок и замен ДНК, а также для редактирования генов или при использовании нескольких комплексов Cas9-gRNA для делеции больших последовательностей ДНК или индукции ДНК. перестановки (). Использование никазы в качестве единственного фермента приводит к образованию одноцепочечного разрыва ДНК с более низкой эффективностью для генерации индел, вставок или замен ДНК, чем комплекс Cas9 дикого типа, но с более низкой вероятностью индуцирования мутаций вне сайта.Эту более низкую эффективность можно преодолеть, нацелив два комплекса никазы на одну и ту же геномную область с двумя разными последовательностями направляющей РНК на противоположных цепях ДНК. Результирующий двухцепочечный разрыв ДНК восстанавливает эффективность генерации индел, вставок и замен ДНК, а также редактирования генов (46–49), сохраняя при этом низкий нецелевой эффект.

Двойной мутант Cas9 (dCas9; D10A, H840A) не обладает нуклеазной активностью, но сохраняет способность связывать ДНК управляемым РНК образом, что делает его полезным для других приложений.Слияние N- или С-конца dCas9 с эффекторными доменами обеспечивает активацию гена (домен VP64) [45,63,64], репрессию (домен KRAB) [45,63], визуализацию (флуоресцентные белки) [65–67] или модификация хроматина (модификатор гистонов или регуляторы метилирования ДНК) [68] (). Интересно, что последовательности sgRNA часто недостаточно для радикального изменения профиля экспрессии гена, вместо этого часто требуется пул до пяти направляющих последовательностей РНК, чтобы нацелить несколько комплексов на одну и ту же область. Чтобы обойти это препятствие, структурно-управляемая инженерия комплекса CRISPR / Cas9 продуцировала внутренний домен VP64 с дополнительными последовательностями аптамеров РНК в гРНК, которые облегчают рекрутирование слитых с аптамером доменов активаторных доменов в комплекс CRISPR / Cas9 [69]. ].Это приводит к образованию комплекса dCas9-VP64: sgRNA: аптамер-эффектор, который очень эффективно активирует транскрипцию промотора гена с помощью sgRNA ().

Как выбрать направляющую РНК?

Самой сложной задачей в процессе применения технологии CRISPR / Cas9 является определение «лучшей» направляющей последовательности РНК. Чтобы увеличить вероятность выбора высокоэффективной направляющей РНК, необходимо учитывать несколько выбранных параметров. Первый — это выбор положения направляющей последовательности относительно интересующей области (промотор, энхансер, кодирующая область, нетранслируемая область, миРНК и т. Д.)), который зависит от предполагаемого приложения (). Для активации транскрипции направляющая последовательность должна располагаться на 450–50 нуклеотидов выше сайта начала транскрипции (TSS), тогда как для репрессии транскрипции она должна находиться на 50–450 нуклеотидов ниже TSS [45]. Для генерации индел-мутаций с целью разрушения гена направляющая последовательность в идеале должна располагаться в пределах первых трех экзонов интересующего гена [41]. Однако недавняя работа продемонстрировала, что направляющие РНК, нацеленные на функциональные белковые домены, имеют более высокую вероятность вызвать нарушение функции генов, чем другие направляющие РНК [70].Для редактирования генов в форме введения кодирующих миссенс-мутаций или маркировки генов направляющая последовательность должна быть расположена в соседнем интроне или некодирующей области, чтобы избежать непреднамеренного нарушения другого аллеля [37].

Руководство по выбору направляющей РНК. (A) Схема, иллюстрирующая случайную открытую рамку считывания генома и положение различных направляющих РНК ( стрелки, ), характерные для выделенного приложения. Транскрипция мРНК начинается с сайта начала транскрипции (TSS) и генерирует транскрипт, содержащий экзоны ( пронумерованные прямоугольники ) и интроны, а также 5′- и 3′-нетранслируемые области (UTR). (B) Блок-схема, выделяющая отдельные этапы выбора и конструирования гРНК.

После выбора приблизительной области-мишени генома для идентификации конкретной направляющей последовательности используются данные, полученные в результате высокопроизводительных исследований, в ходе которых были определены основные параметры, влияющие на качество направляющих последовательностей () [41,42,45, 71]. Во-первых, и это наиболее важно, это идентификация последовательности смежного мотива протоспейсера (PAM). Для простоты мы сосредоточимся на последовательностях PAM формата NGG для Cas9 из Streptococcus pyogenes , наиболее широко используемого Cas9.Характеристика 1841 направляющей последовательности, нацеленной на кодирующую последовательность ДНК, показала, что PAM формата GCGG имеют самую высокую вероятность успеха, тогда как gRNA, использующие последовательность PAM CTGG, с наименьшей вероятностью будут функционировать [41]. С точки зрения эффективности и нецелевых эффектов, использование усеченных направляющих последовательностей, как было показано, позволяет поддерживать высокую эффективность попадания в цель, но резко снижает показатели отклонения от цели. Следовательно, длина направляющей РНК, распознающей интересующую ДНК, должна составлять 17–19 нт [42].Кроме того, содержание GC в идеале должно составлять от 50% до 75%, и следует избегать присутствия гомополимеров (GGGG, CCCC, AAAA, TTTT) [45]. Интересно, что направляющие РНК, расположенные на смысловой или антисмысловой цепи, работают с аналогичной эффективностью [45].

Наконец, как только направляющая последовательность РНК была выбрана, последовательность может быть исследована на предмет потенциальных участков отжига вне мишени путем анализа последовательности с помощью опубликованных алгоритмов [41,71]. Зная, что система CRISPR / Cas представляет собой бактериальную иммунную систему и что средний размер бактериального генома составляет 3-5 Мбит / с по сравнению с размером генома человека при 3 миллиардах пар оснований [72-74], потенциальный нецелевой эффекты расщепления последовательностей направляющих РНК увеличиваются в 1000 раз.Следовательно, важно подчеркнуть, что независимо от того, насколько «хороша» выбранная направляющая последовательность, каждая направляющая последовательность будет иметь нецелевые эффекты при использовании в клетках млекопитающих.

Рекомбинантный аденоассоциированный вирус как оптимальная нокаут-матрица

Для эффективного нацеливания гена CRISPR / Cas9 в клетки необходимы два предварительных условия. Во-первых, двухцепочечный разрыв ДНК вблизи желаемой области. Во-вторых, необходимо предоставить матрицу ДНК, которая может индуцировать HDR вместо NHEJ.Были описаны различные гомологически ориентированные матрицы, в том числе одноцепочечные олигонуклеотиды (оцДНК) длиной до 200 нт [75,76], двухцепочечная кольцевая или линеаризованная плазмидная ДНК (дцДНК) с плечами гомологии разной длины, включая бактериальные искусственные хромосомы [77] и одноцепочечная ДНК рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) длиной до 4,5 т.п.н. [37] (). В то время как короткие олигонуклеотиды оцДНК обладают преимуществом быстрого конструирования и генерации, их недостатками являются необходимость нуклеофекции для доставки в клетки, низкая частота рекомбинации и невозможность включения селектируемых маркеров, что приводит к длительному клональному отбору и последующему скринингу.Напротив, длинные матрицы дцДНК с большими плечами гомологии позволяют доставлять гены устойчивости для клональной селекции. Однако основным недостатком дцДНК является то, что она является очень плохим субстратом для HDR, а также ее способность случайным образом интегрироваться в геном посредством NHEJ (). В отличие от олигонуклеотидов, одноцепочечные ДНК-матрицы rAAV сохраняют преимущества длинных плеч гомологии и кодирующих генов устойчивости для повышения эффективности рекомбинации с низкими скоростями NHEJ, будучи предпочтительной матрицей для HDR, что приводит к высоким частотам нацеливания [78].Однако векторы rAAV могут интегрироваться в сайты с низкой гомологией NHEJ-зависимым образом, но этот процесс далеко не случайный [79]. Факторы, определяющие скорость «случайной» интеграции, включают тип клеток и участки генома. Интересно, что 3–8% всех «случайных» интеграционных событий происходят в повторах рибосомной ДНК [80,81]. Кроме того, CpG-островки и TSS (± 1000 п.н.) были идентифицированы как предпочтительные «случайные» сайты интеграции [82]. Хотя никакого объяснения этому «неслучайному» событию дано не было, вполне вероятно, что причиной этих событий является высокое содержание CG (> 70%) в rAAV.Для идентификации NHEJ-зависимой интеграции rAAV использовали Саузерн-блоттинг, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), флуоресцентный гибридизационный анализ in situ [83,84] или челночные векторы rAAV для идентификации последовательности вектора: соединения хромосом [85, 86].

Преимущества и недостатки шаблонов гомологически-направленного восстановления (HDR). Олигонуклеотиды длиной до 200 оснований, кольцевая или линейная плазмидная ДНК и одноцепочечная ДНК в форме рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) являются наиболее часто используемыми матрицами HDR.Перечислены положительные (, зеленая рамка, ) и отрицательные (, фиолетовая рамка, ) особенности каждого типа шаблона.

rAAV как средство доставки ДНК

AAV представляет собой одноцепочечный ДНК-вирус семейства Parvoviridae . AAV, независимо от серотипа, представляют собой небольшие икосаэдрические вирусы с одним ДНК-геномом размером 4,7 т.п.н., который содержит перевернутые концевые повторы в форме шпильки на 5′- и 3′-концах. AAV содержит две открытые рамки считывания, rep и cap, для неструктурных и структурных генов соответственно.Удалив гены rep и cap и заменив их последовательностями трансгенных млекопитающих и предоставив ген cap в форме котрансфицированной плазмиды, rAAV может быть получен в культуре клеток для целей редактирования генов. Сообщалось о девяти серотипах AAV (AAV1–9), причем AAV2 чаще всего обнаруживается у людей (80%). Кроме того, химерный серотип (AAV-DJ) был сконструирован in vitro с капсидным белком, содержащим 60-аминокислотный гибрид, полученный из типов 2/8/9, который превосходит большинство естественных серотипов в культуре клеток [87].В соответствии с руководящими принципами NIH, серотипы 1–4 и все рекомбинантные конструкции rAAV, которые не содержат потенциально канцерогенных генных продуктов или молекул токсинов и которые продуцируются в отсутствие вспомогательного вируса, могут обрабатываться на уровне биобезопасности 1, что делает rAAV широко распространенным. полезный реагент для редактирования генов с минимальными или нулевыми проблемами биобезопасности.

Кассеты выбора

В зависимости от желаемого события нацеливания на гены существует несколько способов создания шаблона rAAV для HDR. иллюстрирует наиболее часто используемые стратегии нацеливания, а именно введение кодирующих миссенс-мутаций, преждевременных стоп-кодонов и N- и C-концевого мечения генов.Среди прочего, мы обсуждаем два разных подхода к введению кодирования миссенс-мутаций, которые различаются соответствующим дизайном шаблона. Первый использует сайт акцептора сплайсинга (SA), связанный с внутренним сайтом входа в рибосомы (IRES) и геном отбора [88], либо геном устойчивости к антибиотикам, либо репортером флуоресценции для последующей клональной селекции или сортировки отдельных клеток, соответственно, что приводит к чрезвычайно высокая частота нацеливания на гены — 80–90% клонов [37]. Эта стратегия особенно полезна, если требуется высокая эффективность.

Стратегии создания шаблонов HDR. Полный шаблон rAAV HDR состоит из левого и правого плеча гомологии ( светло-синий ), содержащих экзоны ( пронумерованные прямоугольники ) и интронов, а также кассету отбора ( красный ), которая отделена от гомологии. руки по сайтам loxP для последующего вырезания Cre-рекомбиназой кассеты отбора. Точечные мутации (, красная стрелка, ), метки (, оранжевый, ) и преждевременные стоп-кодоны (, звездочка, ) могут быть непосредственно клонированы в плечо гомологии для получения окончательного шаблона rAAV HDR.

Однако из-за преждевременного прекращения транскрипции на стоп-кодоне маркера селекции важно подчеркнуть, что интеграция кассеты селекции временно инактивирует аллель. Кассета селекции фланкирована сайтами loxP, что делает возможным опосредованное Cre-рекомбиназой вырезание кассеты селекции и реактивацию целевого аллеля. Если с помощью этой стратегии нацелены основные гены, могут быть получены только гетерозиготные клоны, и потребуется второй раунд нацеливания на гены для получения клонов, гомозиготных по желаемой мутации [37].Если существенный ген гаплонедостаточен, необходимо применить альтернативную стратегию. В этом случае обратная кассета, содержащая промотор и ген отбора, может быть введена в интрон, прилегающий к интересующему сайту. Эта стратегия позволяет избежать временной инактивации аллеля, но имеет недостаток, заключающийся в обеспечении отбора, управляемого промоторами, что в случае интеграции шаблона вне сайта приведет к более высокому уровню жизнеспособных ложноположительных клонов и более трудоемкому клону. процесс выбора.Подобно кассете SA-IRES, управляемая промотором селекционная кассета может быть вырезана рекомбиназой Cre.

Одним из очень полезных приложений для нацеливания на гены является введение N- или C-концевого эпитопа высокой авидности или флуоресцентных меток. Для маркировки N-конца и C-конца требуются разные стратегии. Подобно введению точечных мутаций, введение N-концевых меток использует либо SA-IRES, либо инвертированный промотор для экспрессии гена устойчивости (). Основное отличие по сравнению с введением точечных мутаций состоит в том, что желаемая метка сливается с первым экзоном в процессе создания плеча гомологии.Несмотря на это различие, N-концевые теги и точечные мутации используют схожий дизайн шаблона. Кроме того, была предложена новая конструкция кассеты отбора, но она ожидает лабораторных испытаний. В этой новой конструкции левое плечо гомологии, которое кодирует эндогенный промотор, управляет геном устойчивости, который отделен от экзона 1 интересующего гена последовательностью 2А и желаемой последовательностью метки (). В сочетании с 5 ‘или 3’ кассетой смерти, такой как дифтерийный токсин А, этот подход теоретически значительно снижает частоту ложноположительных клонов, поддерживая количество истинно положительных клонов.Вероятно, самым большим преимуществом этой конструкции является тот факт, что последовательность метки не считается нарушением гомологии, что делает возможным интеграцию даже больших меток, таких как флуоресцентные белки. Напротив, введение С-концевых меток дает высокие скорости нацеливания без необходимости прибегать к SA-IRES или промотору для управления экспрессией гена устойчивости. Вместо этого последний экзон, который содержится в левом плече гомологии, сливается в рамке с желаемой меткой, тем самым удаляя эндогенный стоп-кодон.За меткой следует последовательность пептида 2А в рамке считывания [89], сайт loxP и ген отбора для выбора антибиотика. Другой сайт loxP, за которым следует последовательность тройного стоп-кодона, завершает кассету отбора (). Примечательно, что эта стратегия не инактивирует аллель, что позволяет нацеливать основные гены, не влияя на жизнеспособность клеток. Как и предыдущие шаблоны, кассета для отбора может быть вырезана обработкой Cre-рекомбиназой.

Конструирование плеч гомологии

Тщательный дизайн левого и правого плечей гомологии матрицы важен для успешного нацеливания на гены.Как правило, более длинная матричная ДНК приводит к более высокой эффективности нацеливания [90]. Кроме того, если матричная ДНК содержит разрывы в гомологии, например, миссенс-мутации, метки или кассету отбора, разрыв гомологии должен быть сконструирован таким образом, чтобы он располагался в центре всего шаблона [90]. Поскольку эндогенный геном AAV составляет 4,7 т.п.н. и с максимальной эффективностью упакован капсидными белками, длина матрицы rAAV должна быть близка к 4,5 т.п.н. и никогда не превышать 5,2 т.п.н. Шаблоны более 5.2 т.п.н. будут усечены на 5′-конце в процессе упаковки, что приведет к гетерогенной популяции частиц rAAV с пониженной эффективностью доставки трансгена [91]. В целом, общий размер шаблона rAAV должен составлять около 4–4,5 т.п.н. с разрывами в гомологии как можно ближе к центру шаблона.

В дополнение к этим общим правилам, вот некоторые рекомендации, полученные эмпирическим путем. Во-первых, 5 ‘и 3’ концы левого и правого плеч гомологии должны, если возможно, начинаться и заканчиваться в некодирующих областях соответственно.Хотя процесс HDR является высокоэффективным и в основном безболезненным, эта конструкция позволяет избежать потенциального введения ошибок области кодирования во время процесса рекомбинации. Чтобы сделать идентификацию на основе ПЦР достоверно рекомбинированных клонов в процессе отбора клонов как можно более чувствительной, одно плечо гомологии должно быть меньше 1 т.п.н., а другое плечо должно быть сделано до тех пор, пока это необходимо для «заполнения» rAAV. . Чтобы избежать однонуклеотидных разрывов в гомологии, все ветви гомологии должны быть амплифицированы с использованием проверочных полимераз из геномной ДНК, выделенной из ткани или линии клеток, которые будут использоваться для редактирования генома.

Комбинация CRISPR / Cas9 с шаблонами rAAV для высокоэффективного редактирования генов

Комбинированное использование CRISPR / Cas с донорами rAAV приводит к высокочастотному и безрубцовому нацеливанию на гены [37]. В частности, доноры rAAV дают высокие скорости интеграции на мишени, обеспечивая при этом небольшие эффекты вне мишени и предлагая точное редактирование генов в активно транскрибируемых открытых рамках считывания [37]. Успешное сочетание обеих технологий зависит от нескольких параметров. Помимо дизайна направляющей РНК и донорной матрицы HDR, очень важно эффективное введение отдельных компонентов в клетки.Хотя доставка шаблонов HDR «ограничена» однонитевым rAAV, компоненты системы CRISPR / Cas могут быть доставлены разными способами. Большинство типов клеток можно трансфицировать химерными плазмидными конструкциями. Если это приводит к недостаточным частотам рекомбинации, трансфекция мРНК Cas9 [92] или целого белка может увеличить частоту нацеливания [93]. Совсем недавно компоненты системы CRISPR / Cas были доставлены rAAV [54,58,94]. Однако еще предстоит увидеть, как этот метод доставки Cas9 / gRNA влияет на правильную скорость рекомбинации во время редактирования гена.

Заключительные замечания

Выполнение редактирования генов в клетках человека для создания моделей заболеваний, для повторения эффекта известных мутаций in vitro или для изучения функции белка с мутантными уровнями экспрессии белка на физиологических уровнях остается серьезной проблемой. Первоначальная работа с rAAV продемонстрировала его потенциал в качестве шаблона HDR, но низкая эффективность нацеливания помешала широко использовать эту технологию в лабораториях клеточной биологии. Основной причиной низкой эффективности нацеливания является необходимость двухцепочечного разрыва ДНК вблизи целевой области, которая индуцирует HDR.Система CRISPR / Cas9 закрывает этот пробел, позволяя исследователям целенаправленно воздействовать на ДНК и вызывать разрывы ДНК везде, где присутствует последовательность PAM. Действительно, комбинация обеих технологий, как было показано, приводит к высоким показателям нацеливания на гены для гетерозиготных и гомозиготных стратегий нацеливания [37]. Однако остается несколько открытых вопросов: (1) Как идентифицировать и подтверждать нецелевые эффекты? (2) Как избежать CRISPR / Cas9-опосредованного разреза на второй цепи для гетерозиготных стратегий нацеливания? (3) Как повысить общую эффективность таргетинга с помощью шаблонов HDR, не содержащих выбираемых маркеров?

Во-первых, как идентифицировать нецелевые эффекты, обычно используются два метода: (1) использование инструментов прогнозирования «нецелевых» с последующим стандартным секвенированием и анализом TIDE [95], Surveyor или эндонуклеазой T7 I (T7EI) анализы [34,38] и (2) глубокое секвенирование заданных целевых последовательностей [39,56,96,97].Несмотря на то, что анализы Surveyor и T7EI могут проводиться в обычном порядке на выбранном наборе участков генома, невозможно выполнить эти анализы для всего генома. Напротив, полногеномное (глубокое) секвенирование может выявить все потенциальные нецелевые эффекты, но оно недостаточно рентабельно, чтобы проводить его на регулярной основе в данный момент. Однако такие методы, как GUIDE-seq, Digenome-seq или BLESS, являются потенциальными инструментами для объективного обнаружения расщепления вне мишени с помощью CRISPR / Cas9 [43,98,99]. Кроме того, комбинирование шаблонов CRISPR / Cas9 и rAAV HDR делает создание генно-рекомбинированных ресурсов простым и быстрым, требуя других методов, кроме глубокого секвенирования, для оценки всех потенциальных нецелевых эффектов.В дополнение к CRISPR / Cas9-опосредованным нецелевым эффектам, HDR-шаблон может индуцировать нецелевую случайную интеграцию NHEJ-зависимым образом. Как и ожидалось, эти нецелевые эффекты труднее проанализировать, поскольку интеграция более или менее случайна. Однако для выявления этого эффекта можно использовать выбранные анализы. Наиболее широко используется метод саузерн-блоттинга [100]. Другой подход представлен обнаружением на основе ПЦР шаблона HDR в предсказанных сайтах, не являющихся мишенями направляющей РНК [101], хотя он менее всеобъемлющ.

Во-вторых, нацеливание на единственную копию гена с помощью CRISPR / Cas9 является сложной задачей. В самом деле, когда стратегии нацеливания на ген используются для мутации одной копии аллеля, вторая копия, даже если не рекомбинируется с помощью rAAV, очень вероятно, будет нацелена на CRISPR / Cas9, что приведет к образованию инделя с потенциальными фенотипическими последствиями. Хотя различие между нацеливанием на гетерозиготный и гомозиготный аллель можно провести путем проведения аллель-специфической ПЦР, ограничение присутствия компонентов CRISPR / Cas9 может помочь решить эту проблему.Фактически, использование индуцируемой доксициклином системы CRISPR / Cas9 регулирует частоту и размер модификаций гена-мишени [55]. Альтернативные способы доставки компонентов CRISPR / Cas9 в форме белка [102,103], мРНК [103,104] или расщепленного Cas9 [105,106] также могут улучшить временный контроль над активностью Cas9.

Было показано, что использование выбираемых маркеров в шаблонах rAAV HDR приводит к чрезвычайно высокой скорости редактирования генов выбираемых клонов. Однако по отношению к общему количеству клеток, которые необходимо трансфицировать и трансдуцировать с помощью компонентов CRISPR / Cas9 и матрицы rAAV, этот показатель шокирующе низок.Учитывая тот факт, что во время этих экспериментов было четыре популяции клеток (положительные по CRISPR / Cas9, положительные по матрице rAAV, двойные положительные и двойные отрицательные) и только двойная положительная популяция содержит клетки, которые могут подвергаться достоверной рекомбинации, следующий вопрос Осталось: как увеличить двойное положительное население? Одной из интересных возможностей может быть использование rAAV не только для доставки шаблона HDR, но и для доставки компонентов Cas9. Недавно было показано, что доставка Cas9 и гРНК с помощью rAAV очень эффективна у целых животных путем прямой инъекции [54,58].Однако, приводит ли этот подход вместе с доставкой матрицы rAAV к более высоким «общим» показателям нацеливания на гены без использования селектируемых маркеров, еще предстоит проверить. В целом системы CRISPR / Cas9 превратили то, что ранее было специализированной областью редактирования генома, в широко используемый подход молекулярной клеточной биологии наравне с ПЦР и РНКи.

Благодарности

Мы благодарим A. Springer, A. Kacsinta и S. Heinz за критические комментарии. Подготовка этой статьи была частично поддержана грантами NIH (CA185589).

Заявление об раскрытии информации об авторе

Не существует конкурирующих финансовых интересов.

Ссылки

Test Whole Template — Spread-Health-KPWPCE-Site

Заголовок модуля Intro — Lorem ipsum dolor sit amet, conctetur adipiscing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud упражнение ullamco labouris nisi ut aliquip ex ea Commodo Conquat.

Ссылка на заголовок

Ваше здравоохранение должно быть качественным, доступным и беспроблемным.С Kaiser Permanente ваши специалисты, бригада личной гигиены и план медицинского обслуживания без проблем координируют ваше лечение, поэтому вам не придется это делать. Все и все работают вместе, чтобы сделать ваш уход быстрее, проще и лучше — и помочь вам вести здоровый образ жизни по-своему.

Заголовок модуля водопада

Lorem ipsum dolor sit amet, conctetur adipiscing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua.Ut enim ad minim veniam, quis nostrud упражнение ullamco labouris nisi ut aliquip ex ea Commodo Conquat.

Lorem ipsum dolor sit amet, conctetur adipiscing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua.Ut enim ad minim veniam, quis nostrud упражнение ullamco labouris nisi ut aliquip ex ea Commodo Conquat.

Оставайтесь на связи с Kaiser Permanente

Помогаем Вашингтону процветать

Особый уход в том виде, в каком он должен быть

Мы умеем сохранять ваше здоровье.Но если вы заболеете, наши бригады по уходу знают, что делать, чтобы выздороветь. Как одна из ведущих медицинских групп в Вашингтоне, мы сотрудничаем в разных областях, чтобы быстрее ставить диагноз, более эффективно лечить и улучшать здоровье наших участников. *

Простота комплексного ухода

Когда на карту поставлено ваше здоровье, вам нужен качественный поставщик медицинских услуг.Но что, если бы вы могли получить больше? Как целая команда, которая заботится о вас, опираясь на страховое покрытие, в котором во главу угла ставится ваше здоровье, а не размер прибыли. В действительно интегрированной системе ухода единственная работа, которую вы делаете, — это забота о своем здоровье. Ваше полное здоровье — наша миссия.

Приобретите планы медицинского обслуживания Kaiser Permanente

Если вы являетесь участником Kaiser Permanente, вы получаете больше, чем просто страховой план.Вы получаете высококвалифицированных врачей и индивидуальный подход — и все, что вам нужно, чтобы оставаться здоровым, поставляется в одном удобном пакете.

* Отчет об обследовании населения Вашингтонского альянса здравоохранения за 2018 г., www.wacommunitycheckup.org; Рейтинг распространяется на медицинскую группу Kaiser Permanente Washington, Washington Permanente Medical Group, P.C.

FreeMarker Java Template Engine

Apache FreeMarker ™ — это механизм шаблонов : Java библиотека для вывода текста (веб-страницы HTML, сообщения электронной почты, конфигурация файлы, исходный код и т. д.) на основе шаблонов и меняющихся данных. Шаблоны написаны на языке шаблонов FreeMarker (FTL), который является простым, специализированный язык (а не полноценный язык программирования, такой как PHP). Обычно для подготовить данные (сделать запросы к базе данных, провести бизнес-расчеты). Потом, Apache FreeMarker отображает подготовленные данные с помощью шаблонов. в шаблон, вы сосредоточены на том, как представить данные, а за пределами шаблон вы ориентируетесь на то, какие данные представить.

Этот подход часто называют MVC (Model View Контроллер), который особенно популярен для динамических веб-страниц. Это помогает отделить дизайнеров веб-страниц (авторов HTML) от разработчиков (Обычно программисты на Java). Дизайнеры не столкнутся со сложной логикой в шаблоны и могут изменять внешний вид страницы без помощи программистов необходимость изменить или перекомпилировать код.

Хотя FreeMarker изначально создавался для создания HTML-страниц в Фреймворки веб-приложений MVC, он не привязан к сервлетам, HTML или все, что связано с Интернетом.Он используется в средах, не относящихся к веб-приложениям, как хорошо.

Подробнее см. В Руководстве подробнее …

Некоторые особенности FreeMarker:

• Мощный язык шаблонов: условные блоки, итерации, присваивания, строковые и арифметические операции и форматирование, макросы и функции, включая другие шаблоны, экранирование по умолчанию (необязательно) и многие другие

• Многоцелевой и легкий: нулевые зависимости, любой результат формат, может загружать шаблоны из любого места (подключаемый), многие варианты конфигурации

• С учетом интернационализации / локализации: с учетом языкового стандарта форматирование числа и даты / времени, локализованный шаблон вариации.

• Возможности обработки XML: Поместите XML DOM в модели данных и просматривать их или даже обрабатывать декларативно

• Универсальная модель данных: объекты Java доступны в шаблоне в виде дерева переменных через подключаемые адаптеры, которые решают, как шаблон их видит.

  No related posts.