Премьер монтажная программа: Страница не найдена

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Сюй, П. Д., Ландер, Э. С., и Чжан, Ф. (2014). Разработка и применение CRISPR-Cas9 для геномной инженерии. Сотовый 157, 1262–1278. doi: 10. 1016/j.cell.2014.05.010

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Джинек М., Ист А., Ченг А., Лин С., Ма Э. и Дудна Дж. (2013). РНК-программированное редактирование генома в клетках человека. Элиф . 2:e00471. doi: 10.7554/eLife.00471

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Каменс, Дж. (2015). Репозиторий addgene: международный некоммерческий ресурс плазмид и данных. Рез. нуклеиновых кислот . 43: D1152–D1157. doi: 10.1093/nar/gku893

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Ким Х.С., Чон Ю.К., Хур Дж.К., Ким Дж.-С. и Бэ С. (2019). Редакторы оснований аденина катализируют превращения цитозина в клетках человека. Нац. Биотехнолог . 37, 1145–1148. doi: 10.1038/s41587-019-0254-4

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Ким Ю. Б., Комор А. К., Леви Дж. М., Пакер М. С., Чжао К. Т. и Лю Д. Р. (2017). Увеличение масштаба нацеливания на геном и точность редактирования базы с помощью сконструированных слияний Cas9-цитидиндезаминазы. Нац. Биотехнолог . 35, 371–376. doi: 10.1038/nbt.3803

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Комор, А.С., Ким, Ю.Б., Пакер, М.С., Зурис, Дж.А., и Лю, Д.Р. (2016). Программируемое редактирование целевого основания в геномной ДНК без расщепления двухцепочечной ДНК. Природа 533, 420–424. doi: 10.1038/nature17946

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Komor, A.C., Zhao, K.T., Packer, M.S., Gaudelli, N.M., Waterbury, A.L., Koblan, L.W., et al. (2017). Улучшенное ингибирование эксцизионной репарации оснований и белок бактериофага Mu Gam дает C:G-to-T: редакторы оснований с более высокой эффективностью и чистотой продукта. Науч. Доп. 3:eaao4774. doi: 10.1126/sciadv.aao4774

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Кюглер С. , Килич Э. и Бер М. (2003). Промотор гена синапсина 1 человека обеспечивает высоко специфичную для нейронов долговременную экспрессию трансгена из аденовирусного вектора в головном мозге взрослой крысы в ​​зависимости от трансдуцированной области. Джин Тер . 10, 337–347. doi: 10.1038/sj.gt.3301905

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ли, X., и Хейер, В. Д. (2008). Гомологическая рекомбинация в репарации ДНК и толерантности к повреждениям ДНК. Сотовое разрешение . 18, 99–113. doi: 10.1038/cr.2008.1

Полный текст CrossRef | Google Scholar

Li, X., Wang, Y., Liu, Y., Yang, B., Wang, X., Wei, J., et al. (2018). Базовое редактирование слиянием Cpf1-цитидиндезаминазы. Нац. Биотехнолог . 36, 324–327.doi: 10.1038/nbt.4102

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Лукач Г.Л. и Веркман А.С. (2012). CFTR: сворачивание, неправильное сворачивание и исправление конформационного дефекта ΔF508. Тенденции Мол. Мед . 18, 81–91. doi: 10.1016/j.molmed.2011.10.003

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Мали П., Ян Л., Эсвельт К. М., Аах Дж., Гуэлл М., ДиКарло Дж. Э. и др. (2013). Инженерия генома человека с помощью РНК с помощью Cas9. Наука 339, 823–826. doi: 10.1126/science.1232033

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Мацукас, И. Г. (2018a). Комментарий: программируемое редактирование оснований A·T в G·C в геномной ДНК без расщепления ДНК. Фронт. Гене . 9:21. doi: 10.3389/fgene.2018.00021

Полный текст CrossRef | Google Scholar

Мацукас, И. Г. (2018b). Комментарий: Редактирование РНК с помощью CRISPR-Cas13. Фронт. Гене . 9:134. doi: 10.3389/fgene.2018.00134

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Макгиннисс М.Дж., Браун Д.Х., Фулвайлер А., Мартен М., Лим-Стил Дж.С.Т. и Кабак М.М. (2002). Восемь новых мутаций в гене HEXA. Жен. Мед . 4, 158–161. doi: 10.1097/00125817-200205000-00010

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Мид С., Уитфилд Дж., Поултер М., Шах П., Апхилл Дж., Кэмпбелл Т. и др. (2009). Новый вариант защитного прионного белка, который колокализуется при воздействии куру. Н. англ. Дж. Мед . 361, 2056–2065. doi: 10.1056/NEJMoa0809716

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Молла, К. А., и Ян, Ю. (2019). CRISPR/Cas-опосредованное базовое редактирование: технические аспекты и практическое применение. Тенденции Биотехнологии . 37, 1121–1142. doi: 10.1016/j.tibtech.2019.03.008

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Нисида К., Аразое Т., Ячи Н., Банно С., Какимото М., Табата М. и др. (2016). Направленное редактирование нуклеотидов с использованием гибридных прокариотических и позвоночных адаптивных иммунных систем. Наука 353:aaf8729. doi: 10.1126/science.aaf8729

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Рис, Х. А., и Лю, Д. Р. (2018). Редактирование базы : прецизионная химия генома и транскриптома живых клеток. Нац. Преподобный Жене . 19, 770–788. doi: 10.1038/s41576-018-0059-1

Полный текст CrossRef | Google Scholar

Savic, N., Ringnalda, F.C.A.S., Lindsay, H., Berk, C., Bargsten, K., Li, Y., et al. (2018). Ковалентное связывание матрицы репарации ДНК с нуклеазой CRISPR-Cas9 усиливает репарацию, направленную на гомологию. Элиф . 7:e33761. doi: 10.7554/eLife.33761

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Шарон, Э., Чен, С.А.А., Хосла, Н.М., Смит, Дж.Д., Притчард, Дж.К., и Фрейзер, Х.Б. (2018). Функциональные генетические варианты, выявленные путем массового параллельного точного редактирования генома. Сотовый 175, 544–557.e16. doi: 10.1016/j.cell.2018.08.057

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Сонг Ф. и Стигер К. (2017). Оптимизация матрицы донора ДНК для направленной по гомологии репарации двухцепочечных разрывов. Мол. тер. Нуклеиновые кислоты . 7, 53–60. doi: 10.1016/j.omtn.2017.02.006

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Штернберг С. Х. и Дудна Дж. А. (2015). Расширение набора инструментов биолога с помощью CRISPR-Cas9. Мол. Сотовый . 58, 568–574. doi: 10.1016/j.molcel.2015.02.032

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Вакульскас, К.А., Девер, Д.П., Реттиг, Г.Р., Терк, Р., Якоби, А.М., Коллингвуд, М.А., и др. (2018). Высокоточный Cas9мутант, доставляемый в виде рибонуклеопротеинового комплекса, обеспечивает эффективное редактирование генов в гемопоэтических стволовых клетках человека и клетках-предшественниках. Нац. Мед . 24, 1216–1224. doi: 10.1038/s41591-018-0137-0

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Ван X., Ли Дж. , Ван Ю., Ян Б., Вэй Дж., Ву Дж. и др. (2018). Эффективное редактирование оснований в метилированных областях с помощью слияния apobec3a-cas9 человека. Нац. Биотехнолог . 36, 946–949. doi: 10.1038/nbt.4198

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Ян Б., Ян Л. и Чен Дж. (2019). Разработка и применение базовых редакторов. Крис. Дж . 2, 91–104. doi: 10.1089/crispr.2019.0001

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Ян Л., Ян Дж. Л., Бирн С., Пан Дж. и Черч Г. М. (2014). CRISPR/Cas9-направленное редактирование генома культивируемых клеток. Курс. протокол Мол. Биол . 107, 31.1.1-31.1.17. дои: 10.1002/0471142727.mb3101s107

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Веб-инструмент для разработки руководства по прайм-редактированию РНК

• Список журналов
• Рукописи авторов HHS
• PMC7882013

Nat Biomed Eng. Авторская рукопись; доступно в PMC 2021 28 марта.

Опубликовано в окончательной редакции как:

Nat Biomed Eng. 2021 февраль; 5(2): 190–194.

Published online 2020 Sep 28. doi: 10.1038/s41551-020-00622-8

PMCID: PMC7882013

NIHMSID: NIHMS1625906

PMID: 32989284

, ^{1, 2, 3, 4, и} , ^{4, 5, 6, 7, и} , ^{1, 36, 2, 0235 3 and 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 , *}

Информация об авторе Информация об авторских правах и лицензиях Отказ от ответственности

Дополнительные материалы

Заявление о доступности данных . Однако дизайн направляющих РНК первичного редактирования (pegRNAs), которые необходимо настраивать для каждого редактирования, может быть сложным и занимать много времени. По сравнению с одиночными направляющими РНК (sgRNAs), pegRNAs имеют дополнительное 3′-удлинение, состоящее из сайта связывания праймера и матрицы обратной транскрипции. Здесь мы сообщаем о веб-инструменте, который мы назвали pegFinder (http://pegfinder.sidichenlab.org), для быстрого проектирования пегРНК из эталонных и отредактированных последовательностей ДНК. pegFinder может включать в свою систему ранжирования прогнозы оценки целевого и нецелевого sgRNA и номинирует вторичные никирующие sgRNA для повышения эффективности редактирования. Cas9также поддерживаются варианты с расширенными диапазонами таргетинга. Чтобы облегчить дальнейшие эксперименты, pegFinder создает исчерпывающую таблицу пегРНК-кандидатов, а также олигонуклеотидные последовательности для клонирования.

Технологии, основанные на кластерных регулярно расположенных коротких палиндромных повторах (CRISPR), получили широкое распространение в качестве мощных инструментов для целенаправленных геномных манипуляций ¹ . Недавно была разработана новая основанная на CRISPR стратегия точного редактирования генома, которая позволяет напрямую вписывать различные геномные изменения в целевые сайты, не требуя двухцепочечных разрывов (DSB) или донорских матриц ² . Этот подход, называемый первичным редактированием, включает два ключевых компонента: 1) каталитически нарушенную CRISPR-ассоциированную протеин 9 (Cas9) никазу, слитую с обратной транскриптазой (PE2), и 2) многофункциональную направляющую РНК первичного редактирования (pegRNA), которая определяет мишень. сайте и в дальнейшем выступает в качестве шаблона для обратной транскрипции (ОТ). pegRNAs похожи на одиночные направляющие РНК (sgRNAs), но дополнительно имеют настраиваемое удлинение на 3′-конце. 3’-удлинение состоит из матрицы RT, которая кодирует желаемое редактирование, и сайта связывания праймеров (PBS), который отжигается с целевым геномным сайтом для праймирования реакции RT 9.0235 2 . Вторичные разрывы sgRNAs также могут быть использованы для потенциального увеличения эффективности первичного редактирования путем разрыва противоположной нити, таким образом благоприятствуя редактируемой нити во время разрешения гетеродуплекса (PE3) ² . Чтобы повысить специфичность и уменьшить вероятность образования нежелательных DSB, вторичные разрывные sgRNA могут быть сконструированы таким образом, что они становятся активными только после успешного первичного редактирования (PE3b).

Эти дополнительные компоненты значительно усложняют дизайн пегРНК по сравнению со стандартными sgRNA. В частности, было продемонстрировано, что точная длина матрицы RT и последовательности PBS значительно влияет на эффективность первичного редактирования ^2-4 . Вдохновленные разнообразием инструментов, которые были разработаны для идентификации кандидатных sgRNAs в целевой последовательности ДНК ^5-11 , мы стремились создать удобное приложение для разработки pegRNAs. Поэтому мы разработали pegFinder, оптимизированный веб-инструмент, который быстро проектирует и ранжирует pegRNA-кандидаты для указанной пользователем генетической модификации. Веб-портал pegFinder находится в свободном доступе по адресу http://pegfinder.sidichenlab. org (дополнительный рисунок 1).

Открыть в отдельном окне

pegFinder: конструктор пегРНК для первичного редактирования CRISPR.

a . Схема рабочего процесса pegFinder для разработки пегРНК для первичного редактирования CRISPR. b , Критерии, по которым pegFinder идентифицирует спейсеры-кандидаты пегРНК, подходящие для желаемого редактирования генома. c , Обзор факторов, учитываемых pegFinder при ранжировании и выборе спейсеров-кандидатов pegRNA. d , Принципы дизайна, согласно которым pegFinder отдает приоритет последовательностям PBS и матрицам RT, которые составляют 3′-удлинение пегРНК.

pegFinder просто требует двух входных данных: 1) последовательность ДНК дикого типа / эталона целевого сайта и 2) отредактированная / желаемая последовательность ДНК (дополнительный рис. 2 и дополнительная таблица 1). Для рассмотрения прогнозируемых показателей соответствия/несоответствия пользователь может дополнительно включить результаты дизайнера Broad sgRNA (https://portals. broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) ^{6 ,7} или CRISPRscan (https://www.crisprscan.org/?page=sequence) ⁸ с использованием последовательности ДНК дикого типа в качестве входных данных (). При желании также можно указать предварительно выбранную спейсерную последовательность sgRNA. После проверки входных данных pegFinder сначала идентифицирует различия между последовательностями ДНК дикого типа и отредактированными, выполняя выравнивание Needleman-Wunsch с штрафами за аффинные пробелы ¹² . Используя выравнивание, pegFinder выбирает один спейсер sgRNA из подходящих кандидатов. pegFinder отдает приоритет спейсерам, чьи целевые сайты будут нарушены после основного редактирования, дополнительно учитывая расстояние между сайтом с псевдонимом и желаемыми правками (-). Если это предусмотрено, pegFinder будет учитывать целевые/нецелевые баллы при выборе кандидатов-спейсеров. Затем

pegFinder идентифицирует соответствующий шаблон RT и последовательность PBS для создания желаемого редактирования путем оценки положения отредактированных оснований и содержания GC sgRNA соответственно (и дополнительная рис. 2). Кроме того, pegFinder идентифицирует вторичные sgRNA, которые надрезают 40-150 нуклеотидов (настройка по умолчанию) на противоположной цепи от первичной sgRNA (PE3), а также надрезают sgRNA, которые становятся активными только после первичного редактирования (PE3b). Чтобы облегчить быструю экспериментальную реализацию, pegFinder дополнительно генерирует последовательности олигонуклеотидов, которые можно напрямую использовать для клонирования пегРНК в стандартные плазмидные векторы (дополнительная рис. 2).

Учитывая, что первичное редактирование было разработано совсем недавно, правила, управляющие дизайном pegRNA, изучены не полностью. Таким образом, может потребоваться оптимизация пегРНК для каждого экспериментального применения. Поскольку было показано, что эффективность первичного редактирования широко варьируется в зависимости от длины и / или основного состава шаблона RT и PBS ^2-4 , pegFinder сообщает о шаблонах RT и последовательностях PBS различной длины (дополнительная рис. 2). pegFinder также создает загружаемую таблицу, содержащую исчерпывающий каталог кандидатов пегРНК для каждого из спейсеров sgRNA с самым высоким рейтингом, а также соответствующие клонирующие олигопоследовательности (дополнительная таблица 2). Эта таблица может быть непосредственно использована для создания библиотек пегРНК, которые исчерпывающе тестируют различные комбинации спейсеров sgRNA, последовательностей PBS и шаблонов RT для желаемого редактирования. Таким образом, pegFinder может облегчить дальнейшую оптимизацию экспериментов по первичному редактированию.

Для проверки алгоритма проектирования мы сначала сопоставили конструкции pegRNA, рекомендованные pegFinder, с экспериментальными данными, используя первичное редактирование в клетках человека ² , клетках мыши ³ и растениях ⁴ , обнаружив, что pegFinder успешно идентифицировал функциональные pegRNAs в этих системах (дополнительное примечание). Затем мы использовали pegFinder для разработки двух разных пегРНК, нацеленных на человеческий локус HEK3 (также известный как LINC01509 ). Первая пегРНК была разработана для вставки «СТТ» в ту же геномную позицию, что и одна из пегРНК, описанных в исходном исследовании первичного редактирования 9.0235 2 и, таким образом, служил эталоном положительного контроля. При минимальном участии пользователя pegFinder разработал пегРНК-кандидат CTTins, которая была в значительной степени идентична последовательности пегРНК CTTins, описанной ранее ² , что демонстрирует точность алгоритма. Олигонуклеотидные последовательности, созданные с помощью pegFinder, затем непосредственно использовали для лигирования клонирования (Методы). По сравнению с контрольными клетками, совместно трансфицированными PE2 и пустым вектором (), клетки, котрансфицированные PE2 и пегРНК CTTins, сконструированной с помощью pegFinder, демонстрировали признаки первичного редактирования, что определялось анализом второстепенных пиков на хроматограммах секвенирования (). Аналогичным образом мы использовали pegFinder для разработки pegRNA для вставки «CT» в HEK3 локус; это конкретное редактирование (CTins) не выполнялось в исходном исследовании ² . Используя конструкции, полученные с помощью pegFinder, мы наблюдали признаки первичного редактирования в клетках, трансфицированных pegRNA CTins (1), экспериментально демонстрируя функциональность pegRNAs, сконструированных pegFinder.

Открыть в отдельном окне

Экспериментальная проверка пегРНК, разработанных pegFinder.

a , Хроматограмма секвенирования Сайт-мишень HEK3 в клетках, трансфицированных контрольным вектором. b , Хроматограмма секвенирования сайта-мишени HEK3 в клетках, трансфицированных пегРНК, предназначенной для вставки «СТТ» в положение +1 вместе с вторичной никсинговой sgRNA. c . Хроматограмма секвенирования сайта-мишени HEK3 в клетках, трансфицированных пегРНК, предназначенной для вставки «CT» в положение +1 вместе с вторичной никирующей sgRNA. Показаны репрезентативные данные из трех независимых экспериментов.

Вместе эти данные демонстрируют простоту и полезность pegFinder для дизайна pegRNA. pegFinder — это удобный инструмент для исследователей в различных областях, позволяющий быстро освоить универсальность основного редактирования.

Разработка алгоритма pegFinder и веб-сервера

Основной алгоритм pegFinder был разработан на Perl. Веб-портал был реализован в веб-фреймворке реального времени Mojolicious на Perl.

Входы для pegFinder

Для pegFinder требуется как минимум два входа. Во-первых, необходима последовательность ДНК дикого типа интересующей области. Поскольку sgRNAs-кандидаты должны быть найдены в этой последовательности дикого типа, мы рекомендуем > 100 nt флангов вокруг желаемого сайта редактирования. Эти последовательности можно легко найти с помощью браузеров генома, таких как UCSC, IGV или Ensembl BioMart. Во-вторых, отредактированная последовательность ДНК должна быть получена путем модификации последовательности дикого типа для включения желаемых изменений. Обратите внимание, что pegFinder ожидает, что последовательности дикого типа и отредактированные последовательности будут иметь одинаковые 5- и 3-концы, и уведомит пользователя, если это не так. В качестве примера рассмотрим последовательность ДНК дикого типа из 200 нуклеотидов, в которую пользователь хочет вставить последовательность из 10 нуклеотидов после 100 ^-й нуклеотид. Затем отредактированная последовательность должна быть следующей: 100 нуклеотидов — вставка 10 нуклеотидов — 100 нуклеотидов фланк, где 5’ и 3’ 100 нуклеотидов вокруг вставки точно соответствуют 200-нуклеотидной последовательности дикого типа. Таким образом, мы рекомендуем генерировать отредактированную последовательность ДНК, напрямую изменяя ввод ДНК дикого типа, поскольку это гарантирует, что 5 ‘и 3’ фланги останутся идентичными.

По умолчанию pegFinder основывает свои проекты pegRNA на использовании Cas9 дикого типа с мотивом, прилегающим к протоспейсеру NGG (PAM). pegFinder также поддерживает использование Cas9. Варианты -NG или Cas9-SpRY ¹³ , которые расширяют потенциальный диапазон первичных редакторов, хотя такие конструкции еще не тестировались экспериментально. При использовании Cas9-NGG в качестве фермента CRISPR pegFinder может дополнительно включать предсказанные оценки соответствия/несоответствия цели с помощью инструментов разработки sgRNA с оговоркой, что эти алгоритмы оценки были обучены на данных нокаута гена и, следовательно, могут не иметь отношения к первичным монтажные эксперименты. pegFinder может использовать результаты инструмента разработки Broad sgRNA ^6,7 (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) или CRISPRscan ⁸ (https://www.crisprscan.org/?page=sequence), с последовательностью ДНК дикого типа, описанной выше, в качестве входного запроса. Для дизайнера Broad следует выбрать фермент CRISPR SpyoCas9 (NGG) и соответствующий целевой геном. Также обратите внимание, что следует сообщать обо всех невыбранных последовательностях. Полученный файл результатов с разделителями табуляции («Результаты выбора sgRNA») можно сохранить и загрузить в pegFinder. Для CRISPRscan следует выбрать правильный целевой вид, фермент должен быть установлен как Cas9.-NGG, и следует выбрать вариант поиска sgRNAs как с промоторов T7, так и с промоторов Sp6. Созданный файл с разделителями табуляции можно сохранить и загрузить в pegFinder. В качестве другой альтернативы, если пользователь желает указать предварительно выбранную sgRNA, последовательность спейсера из 20 нуклеотидов может быть введена непосредственно в pegFinder. Если была указана предварительно выбранная sgRNA, pegFinder проверит, правильно ли расположена выбранная sgRNA для получения желаемых изменений.

Выравнивание последовательностей ДНК дикого типа и отредактированных последовательностей ДНК

Первым шагом pegFinder является выравнивание последовательностей ДНК дикого типа и отредактированных последовательностей с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша с функцией штрафа за аффинные пробелы ¹² . Отмечаются положения пробелов и несовпадающих оснований, которые затем используются для выбора sgRNA-кандидатов.

Выбор первичных разрывных спейсеров sgRNA для pegRNAs

Если предварительно выбранный спейсер sgRNA не был указан, pegFinder идентифицирует спейсеры-кандидаты sgRNA de novo . После определения диапазона позиций желаемых изменений pegFinder ищет разделители, которые потенциально могут опосредовать желаемый основной результат редактирования. pegFinder определяет спейсеры sgRNA на «смысловой» цепи в качестве потенциальных кандидатов, если выполняются следующие условия: 1) положение разреза sgRNA выше по течению от 5′-наиболее редактируемого основания, 2) 3′-наиболее редактируемое основание находится в пределах 150 н. положение разреза (50 нт для Cas9-NG и 20 нуклеотидов для Cas9-SpRY, учитывая значительно возросшее количество спейсеров-кандидатов для этих вариантов), 3) спейсер не содержит 5 или более последовательных тимидинов, которые могли бы терминировать транскрипцию U6, и, если применимо, 4) спейсер sgRNA имеет общая «нецелевая» оценка уровня I Bin I + Bin II ≤ 1 (согласно определению дизайнера Broad sgRNA) или количество «исходных нецелевых значений» равно 0 (согласно определению CRISPRscan). В то время как оценка Уровня I, равная 1 в конструкторе Broad, обычно указывает на идеальное соответствие нецелевому сайту, в этом контексте она будет просто соответствовать геномному локусу входной последовательности и, следовательно, может быть проигнорирована. Точно так же для спейсеров sgRNA на «антисмысловой» цепи pegFinder определяет спейсер как кандидата, если: 1) положение разреза sgRNA находится ниже 3′-наиболее редактируемого основания (в смысловой ориентации), 2) 5′- наиболее редактируемая база (смысловая ориентация) находится в пределах 150 нт от положения разреза (50 нт для Cas9-NG и 20 нуклеотидов для Cas9-SpRY), 3) нет поли(Т)-трактов, и, если применимо, 4) sgRNA имеет общую «нецелевую» оценку уровня I Bin I + Bin II ≤ 1 (широкий конструктор sgRNA) или количество «начальных отклонений от целей», равное 0 (CRISPRscan).

pegFinder затем ранжирует спейсеры-кандидаты sgRNA на основе их расстояния до первого отредактированного основания, отдавая приоритет спейсерам, сайты-мишени которых будут нарушены при успешном прайм-редактировании (т. е. мутациях в исходной области и/или PAM). Поскольку нарушение сайта-мишени pegRNA уменьшит вероятность повторного редактирования, предполагается, что такие спейсеры будут иметь более высокую эффективность первичного редактирования. При включении показателей прогнозирования целевых показателей из инструментов дизайнера sgRNA pegFinder дополнительно отдает приоритет спейсерам sgRNA с более высокой эффективностью при попадании в цель. Если есть спейсеры-кандидаты с высокими целевыми баллами ≥ 0,5 (широкий дизайнер) или ≥ 25 (CRISPRscan), pegFinder выберет спейсер с кратчайшим расстоянием до ближайшей позиции редактирования, снова отдавая приоритет спейсерам, которые больше не будут работать после успешного завершения. первичное редактирование. В случае совпадения pegFinder выбирает sgRNA с более высоким показателем попадания в цель, если он предоставлен.

Выбор RT-матриц и последовательностей PBS

После выбора первичной sgRNA (или непосредственного использования предварительно выбранной sgRNA, указанной пользователем) pegFinder затем извлекает кандидатные RT-матрицы и последовательности PBS, которые могут быть включены в 3’-удлинение pegRNAs. Для разработки шаблонов RT pegFinder использует отредактированную/нужную последовательность и извлекает ДНК между основным ник-сайтом и самым дальним отредактированным основанием (самое 3′-основание при использовании смысловой цепи sgRNA или 5′-самое основание, если антисмысловая) , плюс дополнительный 1нт. Если результирующая последовательность < 10 нуклеотидов, pegFinder сообщит о шаблонах-кандидатах RT длиной от 10 до 17 нуклеотидов. Если расстояние между основным сайтом ника и самой дальней редактируемой базой составляет ≥ 10 нт, pegFinder сообщит шаблоны RT в диапазоне от +1 до +7 нт от ника до расстояния редактирования. Во всех случаях pegFinder будет помечать RT-шаблоны, которые имеют «C» в качестве своего 5-футового основания (соответствующее «G» в качестве окончательного основания шаблона), поскольку ранее было продемонстрировано, что такие RT-шаблоны демонстрируют более низкую эффективность для основного редактирования. , потенциально из-за взаимодействий спаривания оснований с каркасом sgRNA ² . По умолчанию pegFinder затем выбирает один шаблон RT, выбирая шаблон, представляющий медианную длину среди кандидатов, которые не начинаются с «C», выбирая более короткий шаблон, если имеется четное количество кандидатов. Если нет шаблонов RT, которые не начинаются с «C», pegFinder выберет шаблон средней длины среди всех кандидатов. Поскольку длина шаблона RT может потребовать дальнейшей оптимизации, обо всех шаблонах RT-кандидатах также сообщает pegFinder.

Для конструирования последовательностей PBS pegFinder извлекает последовательности длиной 8–17 нуклеотидов из обратной комплементарности первичной последовательности sgRNA, двигаясь назад от положения -1 (положения перед участком разреза). Следуя рекомендациям исходного исследования ² , pegFinder выбирает одну длину PBS на основе содержания GC в спейсере. В частности, pegFinder использует следующую формулу: рекомендуемая длина PBS = 24 — (GC% / 5) с минимальным и максимальным значением 8–17 нт. Все последовательности PBS 8-17nt сообщаются pegFinder для облегчения экспериментальной оптимизации.

Дизайн последовательностей олигонуклеотидов для клонирования

После выбора первичного спейсера sgRNA, вторичного спейсера sgRNA, матрицы RT и последовательности PBS, pegFinder дополнительно генерирует последовательности олигонуклеотидов, которые можно непосредственно использовать для лигирования клонирования сконструированных pegRNAs и/или sgRNA. Олигонуклеотиды, разработанные pegFinder, предназначены для лигирования путем адаптации протокола lentiGuide-Puro ¹⁴ (см. раздел ниже). Следует отметить, что последовательности pegRNA/sgRNA, которые не начинаются с буквы «G» на 5’-конце, автоматически будут иметь добавленную букву «G» в клонирующих олигонуклеотидных последовательностях для облегчения транскрипции со стандартного промотора U6.

Выходная таблица pegFinder для экспериментальной оптимизации

В то время как pegFinder автоматически рекомендует один дизайн pegRNA для указанного редактирования, pegFinder также создает загружаемую таблицу, содержащую библиотеку дизайнов pegRNA для каждого из спейсеров с самым высоким рейтингом. Пользователь может дополнительно указать, сколько распорок-кандидатов будет включено в таблицу результатов (по умолчанию установлено 3 распорки, каждая с полным набором 3-дюймовых распорок-кандидатов). Для каждой из этих конструкций также предоставляются готовые к клонированию олигонуклеотидные последовательности, что облегчает экспериментальную оптимизацию. Если, например, последующие эксперименты покажут, что спейсер sgRNA, первоначально выбранный pegFinder, неэффективен для индукции первичного редактирования, пользователь может легко обратиться к таблице результатов pegFinder и протестировать альтернативные конструкции sgRNA/pegRNA.

Выбор спейсеров sgRNA для вторичного разрыва

Разрыв противоположной цепи может повысить эффективность первичного редактирования (PE3) ² . Для разработки «вторичных» разрывных sgRNA, которые будут использоваться для PE3, pegFinder идентифицирует спейсеры sgRNA de novo на основе выбранного фермента CRISPR. pegFinder считает sgRNA кандидатом на вторичный разрыв, если: 1) sgRNA нацелена на нить, противоположную первичной sgRNA, 2) вторичный разрыв происходит на расстоянии 40-150 нуклеотидов (диапазон по умолчанию, может быть указан пользователем) от первичного ник, 3) нет поли(Т)-трактов, которые могли бы терминировать транскрипцию U6, и, если применимо, 4) sgRNA имеет сумму «нецелевых» баллов уровня I Bin I + Bin II ≤ 1 (широкий дизайнер) или количество «посев вне цели» равен 0 (CRISPRscan). Затем pegFinder выбирает спейсер sgRNA, который разрывается ближе всего к ± 50 нт от первичной sgRNA с разрывом. При включении прогнозов эффективности на мишени pegFinder выбирает спейсер sgRNA с наивысшим показателем на мишени среди кандидатов на вторичные разрывы sgRNA. Все спейсеры-кандидаты вторичного разрыва sgRNA возвращаются pegFinder для простоты экспериментальной оптимизации.

Для повышения специфичности первичного редактирования Anzalone et al. описали разновидность системы PE3, в которой используются sgRNA со вторичными разрывами, которые активны только после первичного редактирования (PE3b). Когда это возможно, pegFinder также разрабатывает специфические для редактирования вторичные никеры PE3b sgRNA.

Протокол клонирования pegRNA/sgRNA

Используя олигонуклеотидные последовательности, полученные с помощью pegFinder, каждую прямую/обратную пару олигонуклеотидов отжигали в буфере для лигирования T4 (NEB) с T4 PNK для фосфорилирования олигонуклеотидов. Вектор экспрессии пегРНК-реципиента (вектор pU6-pegRNA-GG-акцептор; Addgene #132777, подарок от David Liu) расщепляли с помощью BsaI (NEB). После разбавления олигодуплексов 1:100 первичную разрывную sgRNA, инвариантный каркас и 3′-удлинение лигировали вместе в расщепленный вектор с использованием Quick Ligase (NEB) для получения полной плазмиды pegRNA. Аналогичным образом, разбавленный дуплекс вторичной никсинговой sgRNA лигировали в стандартный вектор sgRNA U6 (такой как вектор lentiGuide-Puro; Addgene #529).63). Обратите внимание, что при использовании альтернативных плазмид для выполнения клонирования pegRNA/sgRNA выступы, полученные с помощью pegFinder, возможно, потребуется настроить, чтобы они соответствовали липким концам после расщепления плазмиды.

Экспериментальная проверка пегРНК

Для вставки +1 СТТ в HEK3 использовалась следующая пегРНК: 5’ GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTGGCCCAAGTCAAAGAGCTTGGCCCAAGTCAAAG

Для вставки +1 ТТ на HEK3 использовалась следующая пегРНК: 5’ GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTCTGCCATCAAGCGTGCTCAGTCTG 3’.

Олигопоследовательности, предоставленные pegFinder, затем клонировали в соответствующие векторы экспрессии, как описано выше. Экспериментальную проверку пегРНК проводили, как описано ранее, с небольшими модификациями ² . Клетки HEK293T (ATCC) высевали на 24-луночные планшеты и через 16 часов трансфицировали при 60-80% конфлюэнтности 2 мкл липофектамина 2000 (ThermoFisher), 1,5 мкг плазмиды pCMV-PE2 (Addgene #132775), 500 нг плазмиды pegRNA (клонированные в Addgene #132777) и 200 нг вторичных разрывных плазмид sgRNA. 50 нг sfGFP-N1 (Addgene #54737) также были включены для оценки эффективности трансфекции. Клетки собирали через 2 дня после трансфекции и геномную ДНК (гДНК) очищали с помощью набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen). Затем геномную область, окружающую целевой сайт пегРНК, амплифицировали с помощью ПЦР со следующими праймерами, используя 200 нг исходной гДНК: Forward, AGGGAAACGCCCATGCAATTAGTCT; Реверс, CTAGCCCCTGTCTAGGAAAAGCTGTC.

ПЦР проводили с использованием полимеразы Phusion Flash High-Fidelity (ThermoFisher) со следующими параметрами: 98°C в течение 2 мин, затем 35 циклов [98°C в течение 1 с, 60°C в течение 5 с и 72°C в течение 5 с], с последующим удлинением при 72°С в течение 2 мин. Полученные ПЦР-ампликоны очищали в геле (Qiagen) и обрабатывали для секвенирования по Сэнгеру (анализатор ДНК Applied Biosystems 3730xL).

Сводка отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Сводке отчета по исследованию природы, связанной с этой статьей.

Доступность данных

Основные данные, подтверждающие результаты этого исследования, доступны в документе и его дополнительной информации. Для pegRNAs, которые были экспериментально протестированы в этом исследовании, вся соответствующая информация представлена ​​в качестве дополнительной информации. Эта информация может быть использована для воссоздания конструкций pegRNA, описанных здесь, через веб-портал pegFinder (http://pegfinder.sidichenlab.org).

Доступность кода

Пользовательский код доступен на GitHub (https://github.com/rdchow/pegfinder). Веб-портал доступен по адресу http://pegfinder.sidichenlab.org.

1625906_SuppTable1

Нажмите здесь для просмотра. ^{(8.9K, xlsx)}

1625906_SuppTable2

Щелкните здесь для просмотра. ^{(20K, xlsx)}

1625906_SuppInfo

Щелкните здесь для просмотра. ^{(770K, pdf)}

Благодарим С. Эйзенбарта за поддержку. RDC поддерживается учебным грантом Yale NIH MSTP (T32GM136651) и стипендией NIH NRSA от NCI (F30CA250249). АО поддерживается учебным грантом Yale MSTP от NIH (T32GM136651) и стипендией NIH NSRA от NHLBI (F30HL149).151). SC поддерживается Yale SBI/Genetics Startup Fund, NIH/NCI/NIDA (DP2CA238295, 1R01CA231112, U54CA209992-8697, R33CA225498, RF1DA048811), DoD (W81XWH-20-1-0072 / BC1

), AACR (4

5, -01-CHEN), Институт исследования рака (CLIP), Фонд V, Фонд семьи Людвиг, Фонд Зонтаг (DSA), Фонд семьи Блаватник и Фонд семьи Шеневерт.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов. Для полного раскрытия: SC является соучредителем, получателем финансирования и научным консультантом EvolveImmune Therapeutics; компания не имеет никакого отношения к этому исследованию.

Дополнительная информация доступна для этого документа по адресу https://doi.org/10.1038/s41551-020-00622-8.

Информация о переизданиях и разрешениях доступна на сайте www.nature.com/reprints.

Примечание издателя : Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

1. Пикар-Оливер А. и Герсбах К.А. Следующее поколение технологий и приложений CRISPR-Cas. Nat Rev Mol Cell Biol 20, 490–507 (2019). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

2. Anzalone AV и другие. Редактирование генома с помощью поиска и замены без двухцепочечных разрывов или донорской ДНК. Природа 576, 149–157 (2019). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

3. Liu Y и другие. Эффективное создание моделей мышей с помощью основной системы редактирования. Обнаружение клеток 6, 1–4 (2020). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

4. Lin Q и другие. Основное редактирование генома риса и пшеницы. Природная биотехнология 38, 582–585 (2020). [PubMed] [Академия Google]

5. Мейер Дж. А., Чжан Ф. и Санджана Н.Э. РУКОВОДСТВА: дизайн sgRNA для скрининга потери функции. Природные методы 14, 831–832 (2017). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

6. Doench JG и другие. Оптимизированный дизайн sgRNA для максимальной активности и минимизации нецелевых эффектов CRISPR-Cas9. Нац. Биотехнолог. 34, 184–191 (2016). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

7. Listgarten J и другие. Прогнозирование нецелевой активности для сквозного дизайна направляющих РНК CRISPR. Природная биомедицинская инженерия 2, 38 (2018). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

8. Морено-Матеос М.А. и другие. CRISPRscan: разработка высокоэффективных sgRNA для нацеливания CRISPR-Cas9 in vivo. Нац. Методы 12, 982–988 (2015). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

9. Haeussler M и другие. Оценка нецелевых и целевых алгоритмов оценки и интеграция в инструмент выбора направляющей РНК CRISPOR. Геномная биология 17, 148 (2016). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

10. Лабун К. и другие. CHOPCHOP v3: расширение веб-инструментов CRISPR за пределы редактирования генома. Нуклеиновые Кислоты Res 47, W171–W174 (2019 г.). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

11. Park J, Bae S & Kim J-S Cas-Designer: веб-инструмент для выбора целевых сайтов CRISPR-Cas9. Биоинформатика 31, 4014–4016 (2015). [PubMed] [Google Scholar]

12. Needleman SB & Wunsch CD Общий метод, применимый для поиска сходства в аминокислотной последовательности двух белков. Журнал молекулярной биологии 48, 443–453 (1970). [PubMed] [Google Scholar]

13. Уолтон Р.Т., Кристи К.А., Уиттакер М.Н. и Кляйнстивер Б.П. Неограниченное нацеливание на геном с помощью сконструированного CRISPR-Cas9, почти не содержащего PAMварианты. Наука 368, 290–296 (2020). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

14. Санджана Н.Е., Шалем О. и Чжан Ф. Улучшенные векторы и полногеномные библиотеки для скрининга CRISPR. Нац. Методы 11, 783–784 (2014). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Сконструированные пегРНК повышают эффективность первичного редактирования

• Список журналов
• Рукописи авторов HHS
• PMC8
  8

Нац биотехнолог. Авторская рукопись; доступно в PMC 2022 4 апреля. 2022 март; 40(3): 402–410.

Опубликовано в Интернете 4 октября 2021 г. doi: 10.1038/s41587-021-01039-7

PMCID: PMC8

8

NIHMSID: NIHMS1729773

608 PMID: 30032

, ^{1, 2, 3, *} , ^{1, 2, 3, *} , ^{1, 2, 3} , ^{1, 2, 3} , ^{1, 2, 3} , ^{1, 2, 3} , ^{1, 2, 3} , ^{1, 2, 3} , ^{1, 2, 3} , ^{1, 2, 3} и ^{1, 2, 3, ‡}

. практически любую комбинацию точечных мутаций, небольших вставок или небольших делеций в ДНК живых клеток. Основная направляющая РНК для редактирования (pegRNA) направляет белок основного редактора в целевой локус, а также кодирует желаемое редактирование. Здесь мы демонстрируем, что деградация 3′-области пегРНК, которая содержит матрицу обратной транскриптазы и сайт связывания праймеров, может отравить активность основных систем редактирования, препятствуя эффективности редактирования. Мы включили мотивы структурированной РНК в 3′-конец пегРНК, которые повышают их стабильность и предотвращают деградацию 3′-удлинения. Полученные сконструированные pegRNAs (epegRNAs) повышают эффективность первичного редактирования в 3-4 раза в клетках HeLa, U2OS и K562 и в первичных фибробластах человека без увеличения активности нецелевого редактирования. Мы оптимизировали выбор 3′-структурного мотива и разработали pegLIT, вычислительный инструмент для идентификации неинтерферирующих нуклеотидных линкеров между пегРНК и 3′-мотивами. Наконец, мы продемонстрировали, что epegRNAs повышают эффективность установки или коррекции мутаций, связанных с заболеванием.

Nelson Randolph Сводка отчета по рукописи пересмотрена.pdf

Способность вносить целенаправленные изменения в геном живых систем продолжает совершенствовать науки о жизни и медицину. Стратегии редактирования ДНК, опосредованные двухцепочечным разрывом (DSB), в которых используются программируемые нуклеазы, такие как нуклеазы ZFN, TALEN или CRISPR-Cas, могут эффективно разрушать гены, вызывая вставки или делеции (indels) в целевом сайте, но DSB также приводят к результатам. которые часто нежелательны, включая неконтролируемое смешение результатов редактирования ^1,2 , более крупные перестройки ДНК ^3–5 , активация p53 ^6–8 и хромотрипсис ^9,10 . Хотя таргетные DSB могут стимулировать точную коррекцию генов посредством репарации, направленной на гомологию, этот процесс неэффективен в большинстве терапевтически релевантных типов клеток ^-11. Напротив, базовые редакторы ^12,13 и первичные редакторы ¹⁴ могут эффективно вносить точные изменения в терапевтически значимые клетки, не требуя DSB. Редакторы оснований цитозина и аденозина позволяют преобразовывать C•G в T•A и A•T в G•C соответственно, в то время как первичные редакторы позволяют устанавливать практически любую локальную мутацию, включая замену, вставку и/или делецию. до десятков пар оснований на целевых участках ДНК.

Системы первичного редактирования (PE) как минимум состоят из двух компонентов: белка, содержащего программируемую ДНК-никазу, слитую со сконструированной обратной транскриптазой (RT), и направляющей РНК первичного редактирования, или pegRNA () ¹⁴ . ПегРНК содержит спейсер, который указывает целевой сайт, каркас sgRNA и 3′-удлинение, которое кодирует желаемое редактирование. Это удлинение содержит сайт связывания праймеров (PBS), который комплементарен части протоспейсера ДНК, и матрицу RT, которая кодирует желаемое редактирование и нижестоящую геномную последовательность. После того, как рибонуклеопротеин PE (RNP) связывается с целевым сайтом и разрывает цепь ДНК, содержащую PAM, образующаяся в результате разрыв цепи ДНК соединяется с PBS в pegRNA, запуская обратную транскрипцию матрицы RT непосредственно в целевой участок ДНК 9.0235 14 . Затем вновь синтезированный 3′-лоскут отредактированной ДНК разрешается путями репарации клеточной ДНК, что приводит к установке желаемого редактирования в целевом сайте.

Открыть в отдельном окне

Укороченные пегРНК ограничивают эффективность первичного редактирования.

( a ) (слева) Схема комплекса первичного редактирования, состоящего из белка первичного редактора (PE), который состоит из никазы Cas9 (nCas9), слитой с модифицированной обратной транскриптазой посредством гибкого линкера и направляющей первичного редактирования. РНК (пэгРНК). (справа) Деградация 3′-удлинения пегРНК экзонуклеазами может снизить эффективность редактирования из-за потери PBS. ( b ) Эффективность редактирования, опосредованная PE3, с добавлением плазмид, экспрессирующих sgRNA, укороченных pegRNA, нацеленных на один и тот же геномный локус ( HEK3 ), нецелевых pegRNA или пегРНК SaCas9. Все пегРНК экспрессируются с промотора U6. Планки данных и погрешностей отражают среднее значение и стандартное отклонение трех независимых биологических повторов. ( c ) Дизайн сконструированных пегРНК (эпегРНК), которые содержат псевдоузел структурированной РНК, защищающий 3′-удлинение от деградации экзонуклеазами.

Универсальность первичного редактирования обусловлена ​​способностью 3′-удлинения пегРНК кодировать широкий спектр редактируемых последовательностей. Несмотря на свою универсальность, эффективность современных основных редакторов существенно различается в зависимости от целевых сайтов и типов ячеек ¹⁴ . В этом исследовании мы сообщаем, что предполагаемая деградация 3′-удлинения pegRNAs может снизить эффективность первичного редактирования. Хотя полученные в результате укороченные pegRNAs конкурируют за вовлечение сайта-мишени, они неспособны к первичному редактированию. Чтобы устранить эту уязвимость, мы определили мотивы РНК, которые защищают целостность pegRNA и в целом улучшают эффективность основного редактирования в различных целевых сайтах в нескольких клеточных линиях и с помощью нескольких способов доставки. Полученные сконструированные pegRNAs (epegRNAs) существенно повышают эффективность и расширяют область применения первичного редактирования.

Стабильность РНК ограничивает эффективность пегРНК

Незащищенные ядерные РНК подвержены деградации как с 5′-, так и с 3′-концов экзонуклеазами ¹⁵ . В отличие от sgRNAs, в которых вся направляющая РНК защищена ассоциированным белком Cas9 ¹⁶ , 3′-удлинение pegRNAs, вероятно, экспонируется в клетках и, таким образом, более восприимчиво к экзонуклеолитической деградации. Мы предположили, что хотя частично деградированные пегРНК могут сохранять свою способность связывать Cas9. и задействовать сайт-мишень ДНК, потеря или укорочение PBS может помешать их способности установить желаемое редактирование, тем самым занимая белки PE и сайты-мишени направляющими РНК, которые не могут опосредовать первичное редактирование.

Чтобы проверить эту гипотезу, мы трансфицировали клетки HEK293T смесями двух плазмид в различных соотношениях, которые генерируют либо полноразмерную пегРНК, содержащую матрицу RT, кодирующую трансверсию T•A-to-A•T, либо укороченную пегРНК, содержащую Матрица RT, кодирующая трансверсию T•A-G•C, но лишенная PBS на 3′-конце. Две пегРНК нацелены либо на одни и те же, либо на разные геномные локусы в клетках человека. Мы также проверили эффект добавления плазмиды, которая генерировала невзаимодействующий SaCas9.pegRNA, которая должна конкурировать за транскрипцию с плазмидами, кодирующими pegRNA SpCas9, но не взаимодействовать с белком первичного редактора. Увеличение продукции укороченной pegRNA приводило к ингибированию активности PE, когда полноразмерная и укороченная pegRNA были нацелены на один и тот же сайт (12). Напротив, ни укороченная pegRNA, нацеленная на другой геномный сайт, ни ненаправленная SpCas9 sgRNA не препятствуют активности PE больше, чем pegRNA SaCas9 (10). Эти данные свидетельствуют о том, что деградированные pegRNAs с укороченными 3′-удлинениями ингибируют активность PE, позволяя некомпетентным к редактированию рибонуклеопротеинам первичного редактора (RNP) конкурировать за целевой геномный локус.

Дизайн сконструированных pegRNAs (epegRNAs), повышающих эффективность первичного редактирования

Определив укороченные pegRNAs как мощный ингибитор первичного редактирования, мы затем попытались свести к минимуму деградацию pegRNA. Мы предположили, что структурированные РНК-мотивы на 3′-конце пегРНК () могут улучшить стабильность пегРНК, что согласуется со способностью структур РНК на 5′- или 3′-концах повышать стабильность мРНК в клетках человека и дрожжей ^17,18 . Например, длинная некодирующая РНК MALAT1 стабилизирована тройной спиралью, которая изолирует ее поли(А)-хвост, ограничивая как деградацию, так и ядерный экспорт ¹⁹ .

Сначала мы проверили, можно ли повысить эффективность первичного редактирования путем включения одного из двух стабильных псевдоузлов на 3′-конце пегРНК: либо модифицированного прекеозина ₁ -1 рибопереключающего аптамера ^20,21 , (evopreQ ₁ ) или псевдоузел со сдвигом рамки от вируса мышиного лейкоза Молони (MMLV) ²² , далее именуемый «mpknot» (дополнительная рис. 1). Мы выбрали evopreQ ₁ , потому что это один из самых маленьких природных структурных мотивов РНК с определенной третичной структурой (длиной 42 нуклеотида, н.) ^20,21 . Мы пришли к выводу, что меньшие мотивы минимизируют образование вторичных структур, которые могут мешать функции pegRNA. Кроме того, более короткие pegRNAs могут быть легче получены путем химического синтеза. Мы выбрали mpknot из-за его третичной структуры и потому, что это эндогенный шаблон для MMLV RT, на основе которого был создан RT в канонических основных редакторах, что повышает вероятность того, что mpknot может помочь рекрутировать RT. Мы проверили, могут ли эти epegRNAs вставлять последовательность метки эпитопа FLAG с использованием PE3 в пяти геномных локусах в HEK29.3Т-клетки (). Чтобы уменьшить вероятность того, что мотив будет мешать функции пегРНК во время первичного редактирования, мы включили 8-нуклеотидный линкер для соединения либо evopreQ ₁ , либо mpknot с 3′-концом PBS epegRNA. Последовательности линкера были сконструированы с использованием ViennaRNA ²³ , чтобы избежать потенциальных взаимодействий спаривания оснований между линкером и PBS или между линкером и спейсером пегРНК ¹⁴ . Мы наблюдали в среднем 2,1-кратное повышение эффективности вставки метки FLAG при использовании epegRNAs по сравнению с каноническими pegRNAs во всех пяти протестированных геномных сайтах без видимых изменений в соотношении edit:indel (дополнительная рис. 2), предполагая, что 3′-концевой псевдоузел мотивы могут улучшить эффективность PE.

Открыть в отдельном окне

Эффективность редактирования PE повышается за счет добавления мотивов структурированной РНК к 3′-концу пегРНК.

( a ) Эффективность PE3-опосредованных вставок эпитопной метки FLAG в позиции редактирования +1 (вставка непосредственно в pegRNA-индуцированный nick-сайт) во множестве геномных локусов в клетках HEK293T с использованием канонических pegRNAs («немодифицированные» ), pegRNAs либо с evopreQ ₁ , либо с mpknot, присоединенными к 3′-концу PBS через 8-нуклеотидный линкер, или pegRNAs, присоединенные только с 8-nt линкерной последовательностью. ( b ) Резюме кратности изменения эффективности редактирования PE по сравнению с каноническими пегРНК указанного редактирования в различных геномных локусах при добавлении указанного 3′-мотива через 8-нуклеотидный линкер или при добавлении только линкера. «Трансверсия» означает мутацию +5 ​​G•C в T•A по RUNX1 , EMX1 , VEGFA и DNMT1 , +1 C•G по T•A по RNF2 , и от +1 T•A до A•T по адресу HEK3 , где положительное целое число указывает расстояние от Cas9сайт ник. «Делегация» означает делецию 15 п.н. в ник-сайте Cas9. Обобщенные здесь данные представлены в (c) и на дополнительном рисунке 2. Горизонтальные полосы показывают средние значения. ( c ) Репрезентативное улучшение эффективности редактирования PE за счет добавления evopreQ ₁ (p) или mpknot (m) через 8-нуклеотидный линкер к пегРНК с различной длиной матрицы (в нуклеотидах, указано). ( d ) Редактирование активности канонических пегРНК и модифицированных пегРНК в трех геномных локусах в клетках HeLa, клетках U2OS и клетках K562. Данные и планки погрешностей в a, c и d отражают среднее значение и стандартное отклонение трех независимых биологических повторов.

Мы охарактеризовали необходимость линкерной последовательности, сравнив способность эпигРНК с 8-нуклеотидными линкерами или без них опосредовать трансверсии или вставки метки FLAG. Мы наблюдали значительное снижение эффективности редактирования PE3 при удалении линкера для epegRNAs, содержащих mpknot (p = 0,022), но без существенной разницы для epegRNAs, содержащих evopreQ ₁ (дополнительная рис. 3), возможно, потому, что evopreQ ₁ меньше чем mpknot, и менее склонен к стерическим столкновениям с RT. В то время как общая средняя эффективность редактирования epegRNAs с помощью evopreQ ₁ были похожи (с линкером или без него), мы отмечали случайное снижение производительности для epegRNAs без линкера (дополнительная рис. 3). Поэтому мы решили включить 8-нуклеотидный линкер, если не указано иное для последующих конструкций epegRNA.

Чтобы гарантировать, что это улучшение эффективности PE не ограничивается epegRNAs с более длинными удлинениями, мы протестировали 148 дополнительных epegRNAs, кодирующих различные точечные мутации или делеции с различной длиной матрицы RT в семи различных геномных сайтах в HEK29.3T-клетки с использованием PE3. Использование любого мотива привело к среднему 1,5-кратному повышению эффективности первичного редактирования по сравнению с эффективностью канонических пегРНК во всех протестированных сайтах и ​​пегРНК в клетках HEK293T без явного изменения соотношения редактирования:индел (- и дополнительные рисунки 4 и 5). ). Вместе эти результаты показывают, что epegRNAs в целом улучшают эффективность PE в клетках HEK293T.

Сконструированные пегРНК улучшают первичное редактирование в нескольких клеточных линиях млекопитающих

Ранее мы наблюдали, что эффективность PE существенно различается между типами клеток млекопитающих ¹⁴ , подчеркивая необходимость тестирования улучшенных систем PE в различных камерах. Мы проверили способность epegRNAs, содержащих мотив 3′ evopreQ ₁ или mpknot, вставлять эпитопную метку FLAG из 24 п.н. по адресу HEK3 , удалять 15 п.н. Т-трансверсия RNF2 через PE3 в клетках K562, U2OS и HeLa. В каждой из этих клеточных линий epegRNAs привели к значительному повышению эффективности редактирования по сравнению с pegRNAs, в среднем в 2,4 раза выше редактирование в клетках K562, в 3,1 раза выше редактирование в клетках HeLa и в 5,6 раза выше редактирование в клетках U2OS во всех протестированных клетках. редактирования () без уменьшения отношения редактирования: вставки (дополнительный рис. 2). Эти результаты показывают, что epegRNAs могут усиливать первичное редактирование во многих клеточных линиях млекопитающих. Кроме того, epegRNAs в большей степени улучшали эффективность редактирования в не-HEK29.3T, чем в клетках HEK293T (и дополнительный рисунок 4 по сравнению с), предполагая, что epegRNAs особенно полезны в клеточных линиях, которые менее эффективно трансфицируются или редактируются исходными системами PE.

Влияние сконструированных пегРНК на нецелевое основное редактирование

Предыдущие исследования показали, что основное редактирование приводит к значительно меньшему нецелевому редактированию, чем другие стратегии редактирования генов CRISPR ^14,24–27 . Чтобы определить, будет ли добавление evopreQ ₁ или mpknot изменили степень нецелевого редактирования, мы обрабатывали клетки HEK293T пегРНК или эпегРНК, нацеленными на HEK3 , EMX1 или FANCF , которые шаблонируют либо трансверсию (T•A-to-A•T по адресу HEK3 или G•C-to-T•A по адресу EMX1 и FANCF ) или удаление 15 п. н. с использованием PE3. Мы измерили степень образования инделей и любых нуклеотидных изменений, которые могли бы возникнуть в результате первичного редактирования в четырех верхних экспериментально подтвержденных нецелевых сайтах 9.0235 28 для каждого целевого локуса и сравнили степень нецелевого редактирования между эпигРНК и немодифицированными пегРНК после обработки PE3. Во всех случаях epegRNAs и pegRNAs демонстрировали ≤0,1% нецелевого первичного редактирования и вставок в исследованных сайтах (дополнительная рис. 6), что позволяет предположить, что epegRNAs и pegRNAs демонстрируют одинаковые уровни нецелевого редактирования.

Основа улучшенного первичного редактирования с помощью сконструированных пегРНК

ЭпегРНК могут улучшать результаты первичного редактирования с помощью различных механизмов, включая устойчивость к деградации, более высокие уровни экспрессии, более эффективный Cas9связывание и/или вовлечение ДНК-мишени в комплексе с Cas9; мы исследовали каждую из этих возможностей.

Чтобы определить, препятствуют ли evopreQ ₁ или mpknot деградации 3′-участка пегРНК, мы сравнили стабильность эпегРНК и пегРНК после инкубации in vitro с ядерными лизатами HEK293T, содержащими эндогенные экзонуклеазы. Мы обнаружили, что пегРНК деградировали в большей степени при таком лечении по сравнению с эпегРНК (в 1,9 раза по сравнению с evopreQ 9).0329 1 и в 1,8 раза по сравнению с mpknot, p<0,005, ). Наоборот, добавление Cas9, который связывает каркас направляющей РНК и, вероятно, защищает основную sgRNA от деградации, восстанавливает количество pegRNA по сравнению с любой из epegRNA, что определяется количественной оценкой RT-qPCR каркаса направляющей РНК (10).

Открыть в отдельном окне

Структурные мотивы повышают стабильность РНК и эффективность обратной транскрипции, но снижают аффинность связывания Cas9.

( a ) Устойчивость немодифицированной пегРНК или эпиРНК, содержащих evopreQ ₁ или mpknot, к деградации при воздействии ядерных лизатов HEK293T. Показанный агарозный гель является репрезентативным для трех экспериментов. Необработанные транскрибированные in vitro pegRNAs или epegRNAs служили в качестве стандартов. Процент оставшейся РНК рассчитывали с помощью денситометрии. Значимость анализировали с использованием двустороннего непарного критерия Стьюдента (p=0,0028 для mpknot и 0,0022 для evopreQ ₁ ). ( b ) Кратность изменения количества каркаса пегРНК по сравнению с немодифицированной пегРНК при воздействии ядерных лизатов HEK293T в отсутствие и в присутствии nCas9, как определено с помощью RT-qPCR каркаса sgRNA. ( c ) Сравнение промежуточных продуктов первичного редактирования, генерируемых PE2, с пегРНК или эпегРНК в RNF2 . Пунктирные линии указывают на полноразмерный продукт обратной транскриптазы, матрицированный пегРНК или эпегРНК, тестируемой в указанном локусе. Ось X относится к положению PE2-индуцированного разрыва с первым основанием 3′ ниже по течению, представленным как положение +1. Гистограммы и круговые диаграммы генерируются из среднего значения трех независимых биологических повторов. ( d ) Эффективность редактирования PE3 в клетках HEK293T с использованием немодифицированных пегРНК, пегРНК, содержащих мотив evopreQ1, или пегРНК, содержащих точечный мутант G15C evopreQ ₁ (M1), который разрушает структуру мотива псевдоузла. ( e ) Фракция RNP Cas9, состоящая из dCas9 и либо немодифицированной пегРНК, либо эпегРНК, содержащая либо evopreQ ₁ , либо mpknot и имеющая шаблонную вставку метки +1 FLAG в HEK3 , связанную с двухцепочечной ДНК, как определено с помощью MST. ( f ) Активация транскрипции CRISPRa с помощью pegRNAs, epegRNAs и sgRNAs. Сообщаемая флуоресценция GFP нормализована по флуоресценции iRFP, экспрессируемой совместно трансфицированной плазмидой. AU, условные единицы. ( г ) Фракция немодифицированной пегРНК или эпегРНК (шаблон +1 FLAG вставки в HEK3 ), содержащая либо evopreQ ₁ , либо mpk, не связанную с H840A nCas9, как определено с помощью микромасштабного термофореза (MST). Планки данных и погрешностей отражают среднее значение и стандартное отклонение трех независимых биологических повторов.

Способность 3′-структурных мотивов увеличивать обилие вышележащей каркасной области () указывает на то, что в деградации pegRNA в ядре преобладает 3′-направленная деградация. Эта модель согласуется с характерным поведением ядерной экзосомы, основного источника оборота РНК в ядре ²⁹ . Однако частично деградированные pegRNAs будут генерировать некомпетентные к редактированию RNP, которые, как ранее было показано, ингибируют прайм-редактирование (4). Чтобы обнаружить частично деградировавшие РНК в клетках, мы проанализировали лизаты клеток HEK293T, трансфицированных плазмидами, кодирующими PE2, и либо пегРНК, либо эпегРНК, матрицирующих либо вставку тега +1 FLAG в HEK3 , либо трансверсию нуклеотидов в EMX1 с помощью нозерн-блоттинга. Мы наблюдали виды РНК, содержащие каркас sgRNA и эквивалентные по размеру sgRNA, что согласуется с нашим предыдущим выводом (1), что Cas9связывание защищает каркас от 3′-направленной деградации (дополнительная рис. 7). Однако лизаты с разными общими уровнями pegRNA или epegRNA имели аналогичные уровни sgRNA-подобных укороченных видов, которые представляли лишь меньшую часть содержания направляющей РНК в лизате (дополнительная рис. 7). Поскольку мы наблюдали сильную деградацию пегРНК, подвергшихся воздействию ядерного лизата in vitro (и ), а пегРНК присутствует на уровнях выше, чем PE2 в клетках HEK293T (), мы подозреваем, что частично деградированные виды пегРНК не накапливаются на уровнях, поддающихся нозерн-блоттингу. обнаружение.

Затем мы исследовали промежуточные продукты редактирования геномных праймов, чтобы лучше понять, как epegRNAs могут обеспечивать повышение эффективности редактирования. В нашей текущей модели 3′-промежуточный лоскут, генерируемый RT-удлинением сайта-мишени с разрывом, превращается в 5′-промежуточный лоскут, заменяя исходную геномную последовательность на вновь синтезированную ¹⁴ . Затем этот 5′-лоскут удаляется экзонуклеазами 5′-3′, и полученный геномный разрыв подвергается лигированию для установки первичного редактирования 9. 0235 14 . В то время как полноразмерные пегРНК, как ожидается, эффективно шаблонируют удлинение ОТ с разрывом геномной цепи, укороченные пегРНК без PBS должны быть неспособны сделать это, вместо этого приводя к надрезу целевой цепи с последующим пережевыванием или удлинением цепи с помощью Ферменты репарации ДНК (в любом случае без шаблонного редактирования). Если с epegRNAs наблюдается большая доля RT-удлиненных промежуточных соединений первичного редактирования, чем с pegRNAs, это может свидетельствовать о том, что добавление мотивов 3′ РНК улучшает целостность PBS.

To capture these intermediates, we transfected HEK293T cells with plasmids encoding PE2 and either unmodified pegRNAs or epegRNAs containing evopreQ ₁ or mpknot that template transversions at HEK3 , DNMT1 , EMX1 , or RNF2 . Затем мы использовали терминальную трансферазу, чтобы пометить олиго-dG 3′-концы геномной ДНК, которые должны включать промежуточные продукты первичного редактирования, которые еще не подверглись лигированию. В каждом случае epegRNAs уменьшали количество некомпетентных к редактированию промежуточных продуктов в целевом сайте в среднем в 2,2 раза по четырем сайтам (и дополнительная рис. 8). Доминантный продукт обратной транскрипции содержал полную последовательность, матрицированную 3′-удлинением, и два нуклеотида, матрицированные двумя последними нуклеотидами каркаса пегРНК, что согласуется с предыдущими in vitro характеристика промежуточных продуктов ПЭ ¹⁴ . Нуклеотиды шаблонного каркаса предположительно удаляются во время репарации ДНК локуса-мишени для получения чисто отредактированных аллелей, которые представляют собой доминантный продукт PE. Эти данные согласуются с моделью, в которой epegRNAs улучшают обратную транскрипцию удлинения pegRNA в сайт-мишень за счет снижения частоты непродуктивного разрыва сайта-мишени от основных редакторов, связанных с укороченными pegRNAs.

Поскольку одноцепочечные 3′-концы являются общей чертой субстратов 3′-экзонуклеаз ³⁰ , мы затем проверили, можно ли объяснить устойчивость к деградации, придаваемую этими мотивами, более механически стабильными третичными структурами псевдоузлов. Примечательно, что добавление шпилек из 15 п.н. (34 нуклеотида) к 3′-концу привело к непоследовательному повышению эффективности PE по сравнению с добавлением псевдоузлов (дополнительная рис. 9), что позволяет предположить, что третичная структура действительно является важной особенностью epegRNAs.

Чтобы проверить, требуется ли третичная структура псевдоузла для опосредованного epegRNA улучшения эффективности PE, мы исследовали эффективность редактирования epegRNAs, содержащих точечную мутацию G15C в evopreQ ₁ , мутацию, которая, как известно, нарушает формирование псевдоузла (M1 на дополнительной рис. 1). ) ²¹ . Мы использовали epegRNAs для установки вставки метки эпитопа FLAG длиной 24 п.н., делеции длиной 15 п.н. или трансверсий в HEK3 или RNF2 в клетках HEK293T с использованием PE3. Действительно, включение мутации G15C в evopreQ ₁ отменил повышение эффективности редактирования (). Эти результаты показывают, что вторичная или третичная структура мотивов имеет решающее значение для опосредованных epegRNA улучшений PE, вероятно, за счет стабилизации 3′-удлинения.

Затем мы проверили, увеличивают ли структурированные 3′-мотивы в epegRNAs уровень их экспрессии по сравнению с pegRNAs. Количественная оценка RT-qPCR каркаса пегРНК выявила зависящие от мишени различия в уровнях экспрессии эпигРНК по сравнению с немодифицированными пегРНК (дополнительная рис. 7).

Для пегРНК, которая является матрицей вставки тега +1 FLAG по адресу HEK3 , мы наблюдали, что добавление evopreQ ₁ или mpknot снижало экспрессию пегРНК в 9,2-9,6 раза, несмотря на то, что приводило к 1,9-кратному повышению эффективности Вставка эпитопа метки FLAG по адресу HEK3 (). Сходным образом, epegRNAs, которые шаблонируют трансверсию DNMT1 , также обнаруживают пониженную экспрессию (в 1,6-2,1 раза). Тем не менее, epegRNAs, которые матричные трансверсии в RNF2 или EMX1 экспрессировались на более высоких уровнях, чем у немодифицированной пегРНК (в 2,2–2,4 раза и в 1,4–3,7 раза соответственно, дополнительная рис. 7). Эти данные свидетельствуют о том, что 3′-мотивы непоследовательно влияют на экспрессию pegRNA, что согласуется с нашими более ранними выводами (1), что эффективность PE в этих условиях трансфекции не ограничивается экспрессией pegRNA в клетках HEK293T. Однако, когда экспрессия epegRNA более ограничена, улучшение экспрессии epegRNA может еще больше повысить эффективность редактирования.

Затем мы проверили, снижает ли добавление структурного мотива 3′-РНК участие целевого участка ДНК, сравнив способность эпигРНК и пегРНК поддерживать активацию транскрипции слияниями dCas9–VP64–p65–Rta (dCas9–VPR) ^32,33 . Клетки HEK293T трансфицировали плазмидами, кодирующими dCas9-VPR, GFP ниже целевого протоспейсера HEK3 , DNMT1 , RNF2 или EMX1 , а также пегРНК, эпиРНК или sgРНК, нацеленных на соответствующие сайты. Активацию транскрипции измеряли по флуоресценции клеточного GFP. В отличие от их способности усиливать активность PE (1), epegRNAs демонстрировали сходную активность Cas9. -зависимая активация транскрипции в клетках HEK293T в виде пегРНК (). ЭпегРНК и пегРНК приводили к меньшей активации транскрипции по сравнению с sgRNA, нацеленной на один и тот же сайт (в 3,0 раза для пегРНК, в 2,3 раза для evopreQ ₁ epegRNA и в 1,9 раза для mpknot epegRNA по четырем сайтам), что позволяет предположить, что 3 ‘удлинение в pegRNAs и epegRNAs незначительно препятствует вовлечению сайта-мишени.

Чтобы выявить потенциальные изменения в вовлечении целевого сайта и различия в экспрессии пегРНК и эпигРНК, мы провели микромасштабный термофорез (МСТ) для измерения аффинности предварительно инкубированных комплексов РНП каталитически инертного Cas9.(dCas9) и pegRNAs или epegRNAs для субстрата dsDNA. Мы обнаружили, что добавление mpknot или evopreQ ₁ приводит к сравнимому или незначительному снижению аффинности связывания с двухцепочечной ДНК по сравнению с немодифицированной пегРНК соответственно (K _D = 10 нМ для evopreQ ₁ epegRNA и 21 нМ для mpknot pegRNA по сравнению с 8,1 нМ для немодифицированная пегРНК). Аффинность pegRNAs к никазе Cas9 H840A также была незначительно снижена для любого мотива (K _D = 18 нМ для evopreQ ₁ epegRNA, 11 нМ для mpknot pegRNA и 5 нМ для немодифицированной pegRNA; ). Эти данные свидетельствуют о том, что повышенная эффективность PE от epegRNAs не возникает из-за улучшенного связывания pegRNA с Cas9.или комплекса PE RNP к целевому сайту.

В совокупности эти результаты позволяют предположить, что epegRNAs более устойчивы к клеточной деградации, чем pegRNAs, и, таким образом, генерируют меньше видов усеченных pegRNA, которые снижают эффективность первичного редактирования. Нельзя исключать дополнительные механизмы, лежащие в основе улучшений от epegRNAs.

Оптимизация сконструированных 3′-мотивов pegRNA

Установив, что epegRNAs улучшают эффективность редактирования за счет устойчивости к экзонуклеолитической деградации, мы предположили, что более стабильные мотивы РНК могут дополнительно улучшать активность PE. Мы провели скрининг 25 дополнительных мотивов структурированной РНК на предмет их способности улучшать эффективность редактирования epegRNA среди эпэгРНК, кодирующих либо вставку эпитопной метки FLAG длиной 24 п. н., либо делецию длиной 15 п.н., либо трансверсию HEK3 или RNF2 (дополнительные рисунки 9 и 10). Эти мотивы включали дополнительные развившиеся прекеозины ₁ -1 рибопереключающие аптамеры ²¹ , варианты mpknot с улучшенной стабильностью псевдоузлов ²² , G-квадруплексы с возрастающей стабильностью ³⁴ , 15-п.н. Домен P4-P6 группы I интрона ³⁶ . В то время как 123 из 137 протестированных epegRNA продемонстрировали улучшенное общее прайм-редактирование по сравнению с соответствующими pegRNA, ни одна из них не продемонстрировала устойчивых улучшений по сравнению с evopreQ 9.0329 1 или mpknot в большинстве проверенных правок (дополнительные рисунки 9 и 10).

Затем мы предположили, что удаление ненужной последовательности из добавленных мотивов evopreQ ₁ и mpknot может еще больше улучшить дизайн epegRNA, поскольку удаление посторонних последовательностей в структурированной РНК может уменьшить склонность к неправильной укладке ³⁷ . Мы обнаружили, что удаление 5 нуклеотидов избыточной последовательности из evopreQ ₁ или mpknot привело к незначительному увеличению средней эффективности редактирования PE3 по сравнению с полноразмерными epegRNAs (дополнительная рис. 10). Поскольку обрезка этих РНК-мотивов не оказывает отрицательного влияния на эффективность редактирования, а более короткие epegRNAs легче получают путем химического синтеза, мы решили использовать урезанный evopreQ 9.0329 1 (tevopreQ ₁ ) в epegRNAs при применении epegRNAs для установки терапевтически значимых мутаций (см. ниже).

Мы также исследовали, будет ли каркас sgRNA с «переворотом и удлинением» (F+E) ³⁸ повышать эффективность редактирования epegRNA. Этот каркас направляющей РНК мутирует четвертую пару оснований прямого повтора с U•A на A•U для удаления потенциального терминатора pol III и удлиняет прямой повтор на пять пар оснований для улучшения связывания Cas9 ³⁸ . Мы преобразовали HEK293T-клетки с лентивирусами, кодирующими немодифицированную (F+E) пегРНК, (F+E) эпегРНК, содержащую tevopreQ ₁ , или tevopreQ ₁ epegRNA со стандартным каркасом, который матрицирует трансверсию по HEK3 или DNMT1 или вставка из 3 нт по адресу HEK3 . Использование tevopreQ ₁ значительно повысило эффективность редактирования (в 3,8 раза для трансверсии нуклеотидов и в 2,6 раза для вставки 3 нуклеотидов в HEK3 и в 6,8 раза в DNMT1 ) (дополнительный рис. 11). Использование каркаса (F+E) в эпегРНК tevopreQ ₁ дополнительно повысило эффективность редактирования (в 1,1 раза для трансверсии нуклеотидов, в 1,5 раза для вставки 3 нуклеотидов в HEK3 и в 2,5 раза в DNMT1). ). Мы также охарактеризовали варианты каркаса sgRNA, ранее показавшие, что они повышают активность Cas9-нуклеазы ³⁹ в условиях трансфекции с уменьшенным количеством плазмиды, и наблюдали аналогичные общие преимущества, хотя и с большей вариабельностью (дополнительное обсуждение, дополнительная рис. 12). Эти находки также предполагают, что epegRNAs обеспечивают большее улучшение эффективности PE, когда экспрессия ограничена. Кроме того, эти данные подчеркивают потенциал модифицированных каркасов для повышения эффективности PE в сочетании с epegRNAs, хотя необходимо более глубокое исследование этой возможности.

Вычислительный инструмент для разработки линкеров эпигРНК

В отличие от белковых линкеров, линкеры РНК более вероятно зависят от последовательности, так что один и тот же линкер может функционировать для одной эпигРНК, но препятствовать другой. Чтобы свести к минимуму возможность вмешательства со стороны линкера эпигРНК, мы разработали pegLIT (инструмент идентификации линкера пегРНК) (дополнительное обсуждение, дополнительная рис. 13), вычислительный инструмент, который идентифицирует последовательности линкера, предсказанные для минимальной пары оснований с остатком epegRNA. Для первоначальной проверки мы протестировали два набора из 15 evopreQ 9.0329 1 epegRNAs с разными линкерами, матрицирующими трансверсию C•G-to-A•T в RNF2 или делецию 15 п.н. в DNMT1 . В каждом наборе pegLIT рекомендовал пять линкеров; пять были предсказаны как пары оснований со спейсером, а пять были предсказаны как пары оснований с PBS. Использование разработанных pegLIT линкеров привело к умеренному повышению эффективности редактирования PE3 по сравнению с использованием разработанных вручную линкеров (в 1,2 раза выше для RNF2 и и в 1,1 раза выше для DNMT1 ) (дополнительный рис. 13). В то время как взаимодействия спейсеров не оказывали существенного влияния на эффективность редактирования, взаимодействия линкер-PBS коррелировали со снижением эффективности редактирования PE3, что приводило к снижению эффективности редактирования в 1,3 и 1,1 раза по сравнению с линкерами pegLIT для RNF2 и DNMT1 соответственно. Два линкера с наихудшими показателями, которые привели к менее эффективному редактированию PE3 в 1,9 и 3,4 раза при RNF2 по сравнению с оптимальными последовательностями линкера, были правильно идентифицированы с помощью pegLIT как плохие оценки для взаимодействий с PBS (дополнительная рис. 13). Ближайшая близость линкера к PBS по сравнению со спейсером может дать взаимодействию линкер:PBS энтропийное преимущество по сравнению с парой линкер:спейсер. Затем мы попытались определить, могут ли линкерные последовательности, сконструированные pegLIT, повысить эффективность двух эпигРНК (шаблон трансверсии G•C-to-T•A в положении 9). 0011 EMX1 и делеция 15 п.н. в VEGFA ), которые изначально не демонстрировали улучшенного редактирования (дополнительная рис. 4). Действительно, использование линкеров, разработанных pegLIT, повысило эффективность редактирования PE3 в 1,3 и 1,4 раза соответственно по сравнению с пегРНК для этих двух правок (дополнительная рис. 13). В совокупности эти результаты демонстрируют, что pegLIT облегчает использование epegRNAs для последовательного улучшения основных результатов редактирования.

Мы также исследовали, улучшают ли линкеры, сконструированные с помощью pegLIT, активность эпэгРНК по сравнению с эпэгРНК без линкеров. По сравнению с epegRNAs mpknot без линкера добавление линкера, разработанного pegLIT, привело к значительному повышению эффективности редактирования, чем при использовании линкеров, разработанных вручную (дополнительные рисунки 3 и 13). Напротив, использование линкеров pegLIT с evopreQ ₁ или tevopreQ ₁ epegRNAs значительно не увеличивали редактирование по сравнению с epegRNAs без линкера (дополнительная рис. 13). Поэтому мы рекомендуем использовать разработанные pegLIT линкеры в epegRNAs с использованием более крупных мотивов структурированной РНК, таких как mpknot.

Повышенная эффективность редактирования с помощью химически модифицированных эпэгРНК

Химически синтезированные гРНК обычно используются при трансфекции клеток мРНК или РНП ⁴⁰ . Хотя синтетические гРНК могут включать химические модификации, повышающие устойчивость к экзонуклеолитической деградации ^16,40 , мы предположили, что структурные мотивы все еще могут способствовать дополнительным улучшениям в сочетании с такими модификациями.

Чтобы проверить эту возможность, мы сравнили эффективность первичного редактирования синтетических tevopreQ ₁ эпэгРНК с эффективностью синтетических эпэгРНК, которые устанавливают либо точечную мутацию, либо делецию 15 п. , RUNX1 и EMX1 ) в ячейках HEK293T. Как epegRNAs, так и pegRNAs содержали 2′-O-метильные модификации и фосфоротиоатные связи между первым и последним тремя нуклеотидами РНК. Для шести из семи протестированных pegRNAs соответствующие epegRNAs демонстрировали в 1,1–3,1 раза более высокое редактирование с неизменными соотношениями edit:indel (дополнительная рис. 14). Эти данные предполагают, что epegRNAs также улучшают результаты PE по сравнению с pegRNAs в приложениях, которые используют химически синтезированные и модифицированные pegRNAs.

Сконструированные пегРНК улучшают первичное редактирование терапевтически значимых мутаций

Подтвердив использование эпегРНК в качестве стратегии широкого улучшения активности ПЭ, мы затем сравнили активность эпегРНК, содержащих tevopreQ ₁ , с активностью пегРНК для установки различных защитных или терапевтические генетические мутации. Мы успешно использовали epegRNAs для установки аллеля PRNP G127V, защищающего от прионной болезни человека ^41,42 в HEK29.3Т-клетки с эффективностью в 1,4 раза выше, чем у канонической пегРНК (). Кроме того, мы использовали эпегРНК для коррекции наиболее распространенной причины болезни Тея-Сакса ( HEXA ^1278+TATC ) в ранее сконструированных клеточных линиях HEXA ^1278+TATC HEK с помощью плазмидной липофекции и в первичных фибробластах, полученных от пациентов, с помощью нуклеофекции in vitro , транскрибируемой мРНК и синтетической пегРНК (и). В обоих случаях мы наблюдали повышение эффективности редактирования для tevopreQ 9.0329 1 epegRNAs, содержащие разработанные pegLIT 8-нуклеотидные линкеры по сравнению с каноническими pegRNAs (в 2,8 раза выше в клетках HEK293T и в 2,3 раза выше в фибробластах, полученных от пациентов).

Открыть в отдельном окне

Эффективность терапевтически значимого редактирования генома при первичном редактировании повышается за счет использования эпегРНК.

( a ) PE3-опосредованная установка мутации G127V в PRNP , которая защищает от прионной болезни человека ^41,42 и ( b ) коррекция патогенной вставки c1278TATC в HEXA , которая вызывает болезнь Тея-Сакса как в клетках HEK293T, так и ( c ) в первичных фибробластах, полученных от пациента. ( d ) Сравнение PE2-опосредованной установки патогенных и защитных аллелей с использованием неоптимизированных epegRNAs или неоптимизированных pegRNAs в девяти геномных сайтах. Справочные обозначения SNP (rs) можно найти для всех мутаций в дополнительной таблице 6. Данные и планки погрешностей в a, d и e отражают среднее значение и стандартное отклонение трех независимых биологических повторов.

Установка терапевтически релевантных правок с использованием неоптимизированных epegRNAs

Дизайн и скрининг многих pegRNAs с различными матрицами PBS и RT является важным первым шагом в успешном использовании первичного редактирования ¹⁴ . Хотя общие правила, регулирующие длину и состав матрицы PBS и RT, были описаны ^14,43 , идентификация оптимальных пегРНК часто требует тщательного скрининга конструкций пегРНК. Мы предположили, что epegRNAs могут поддерживать более эффективную установку терапевтически релевантных простых правок без обширной оптимизации pegRNA. Мы исследовали способность неоптимизированных pegRNAs и epegRNAs шаблонировать установку девяти защитных или патогенных точечных мутаций, используя PE2. Во всех случаях пегРНК и эпегРНК, использованные в этом эксперименте, содержали 13-нуклеотидный PBS и матрицу ОТ, содержащую 10 нуклеотидов, гомологичных целевому сайту после последнего отредактированного нуклеотида, за исключением случаев, когда 3′-удлинение начиналось с цитозина 9. 0235 14 , и в этом случае он был расширен до ближайшего нуклеотида, отличного от C.

Мы исследовали pegRNAs, которые устанавливают терапевтически значимые мутации, связанные с болезнью Альцгеймера ⁴⁴ , ишемической болезнью сердца ^45,46 , диабетом 2 типа ⁴⁷ , врожденным иммунитетом ⁴⁸ , 6 902 нарушением дефицита ламин 3 ^{CDKL5 4 90 дефицит 50 и синдром Ретта 51,52 . Мы сравнили результаты первичного редактирования с помощью пегРНК и соответствующего tevopreQ 9.0329 1 epegRNAs с 8-нуклеотидными линкерами pegLIT в клетках HEK293T (). Для каждой мишени тестировалась только одна конструкция pegRNA или epegRNA. В каждом случае epegRNAs превосходили pegRNAs по эффективности редактирования. Для пяти из девяти протестированных терапевтически значимых правок epegRNAs приводили к эффективности редактирования ≥20%, чего обычно достаточно для создания модельных клеточных линий. Для сравнения, только три из девяти пегРНК достигли такого уровня эффективности редактирования. Более высокая эффективность редактирования, опосредованная epegRNAs (в среднем в 2,8 раза выше, чем у pegRNAs), должна упростить производство гомозиготных клеточных линий, что является важным фактором для моделирования рецессивных мутаций. Точно так же неоптимизированные epegRNAs опосредовали вставку метки FLAG из 24 п.н. с эффективностью ≥10% в 5 из 15 протестированных сайтов; соответствующие пегРНК не достигли эффективности ≥10% ни на одном из протестированных сайтов (дополнительное обсуждение и дополнительная рис. 15). В совокупности эти данные демонстрируют, что epegRNAs упрощают производство модельных клеточных линий с PE.}

Здесь мы сообщаем о дизайне, характеристике и проверке сконструированных пегРНК для устранения основного узкого места в основном редактировании. Эти epegRNAs содержат мотив структурированной РНК 3′ от PBS, который предотвращает деградацию удлинения pegRNA и последующее образование некомпетентных к редактированию PE-комплексов, которые конкурируют за доступ к целевому геномному сайту. Мы обнаружили, что epegRNAs в целом улучшают эффективность PE во всех пяти протестированных клеточных линиях и первичных типах клеток, причем более значительные улучшения наблюдаются в клеточных линиях, трансфекция которых затруднена. Кроме того, мы заметили, что использование epegRNAs может повысить эффективность первичного редактирования при использовании химически модифицированных pegRNA, при установке терапевтически релевантных изменений в клетках человека и при использовании неоптимизированных конструкций pegRNA. Наконец, мы описываем вычислительную программу, которая ускоряет дизайн epegRNA, идентифицируя линкеры, которые минимизируют риск контрпродуктивной вторичной структуры. В целом, наши результаты показывают, что epegRNAs в целом улучшают результаты первичного редактирования в самых разных геномных локусах, типах редактирования (замены, вставки и делеции) и типах клеток.

Улучшения в первичном редактировании с помощью epegRNAs, вероятно, зависят от стратегии доставки. Способы доставки с более низким уровнем экспрессии, такие как некоторые вирусные векторы, могут более эффективно использовать epegRNAs, когда концентрация pegRNA ограничивается (дополнительная рис. 12). Точно так же дальнейшие улучшения в синтезе химически модифицированных РНК могут уменьшить преимущества epegRNAs за счет лучшего смягчения деградации. Кроме того, большая длина epegRNAs (дополнительно 37 нуклеотидов при использовании tevopreQ ₁ ) является важным соображением при использовании синтетических epegRNAs, учитывая текущие проблемы химического синтеза более длинных РНК.

Мы рекомендуем использовать эпигРНК для всех экспериментов по первичному редактированию, которые могут поддерживать немного более длинные пегРНК. Важно отметить, что исследователи, стремящиеся идентифицировать первичные агенты редактирования, которые устанавливают желаемое редактирование с максимально возможной эффективностью, должны продолжать тестировать множество epegRNAs, которые включают различные матричные последовательности и длины PBS и RT, а также различные sgRNA с разрывом при использовании PE3. Включение вариантов каркаса направляющей РНК ^38,39 также может дополнительно повысить эффективность PE в зависимости от сайта (дополнительные рисунки 11 и 12). Однако, как показано в этом исследовании, обширный скрининг может не понадобиться, если максимальная эффективность редактирования не является критически важной. В этих случаях epegRNA, содержащая урезанный мотив evopreQ ₁ (tevopreQ ₁ ) с длиной PBS 13 и матрицей, которая включает либо 10 нуклеотидов гомологии после целевого редактирования для небольших вставок, делеций и точечных мутаций — или 25 нуклеотидов гомологии для более крупных вставок или делеций — обеспечивает многообещающую отправную точку для дизайна epegRNA. Затем можно оптимизировать PBS, длину шаблона RT, последовательность каркаса и разрыв sgRNA, если наблюдаемая эффективность редактирования недостаточна.

Общие методы.

Плазмиды, экспрессирующие pegRNAs и epegRNAs, были клонированы с помощью сборки Gibson, сборки Golden Gate с использованием либо ранее описанной заказной акцепторной плазмиды ¹⁴ , либо недавно разработанных заказных плазмид-акцептора, содержащих обрезанный evopreQ ₁ или mpknot (использование которых описано в дополнительном примечании 1), или синтезированы и клонированы Twist Biosciences. Плазмиды, экспрессирующие sgRNA, клонировали с помощью сборки Gibson или USER. Амплификацию ДНК проводили с помощью ПЦР с использованием Phusion U или High Fidelity Phusion Green Hot Start II (New England Biolabs). Плазмиды, экспрессирующие пегРНК, очищали с использованием минипрепаратов плазмид PureYield (Promega) при трансфекции HEK29.3T или наборами Plasmid Plus Midiprep (Qiagen) при трансфекции других типов клеток, в то время как плазмиды, экспрессирующие главные редакторы, очищали исключительно с использованием наборов Plasmid Plus Midiprep. Плазмиды, заказанные в Twist Biosciences, ресуспендировали в воде, не содержащей нуклеаз, и использовали непосредственно. Праймеры и фрагменты двухцепочечной ДНК заказывали в компании Integrated DNA Technologies (IDT). Необрезанные гели агарозы и нозерн-блоттинга представлены на дополнительных рисунках. 16 и 17.

Синтетические пегРНК и генерация транскрибируемой in vitro мРНК.

Синтетические пегРНК были заказаны в IDT и содержали модификации 2′-O-метила в первых и последних трех нуклеотидах и фосфоротиоатные связи между тремя первым и последним нуклеотидами и использовались непосредственно. Синтетические разрывные sgRNA были заказаны у Synthego и содержали модификации 2′-O-метила в трех первых и последних нуклеотидах и фосфоротиоатные связи между первыми тремя и последними двумя нуклеотидами. PE-кодируемая мРНК была транскрибирована in vitro с использованием протокола, описанного ранее ⁵³ . Вкратце, кассету PE2, состоящую из 5′-UTR, последовательности Козака, ORF PE2 и 3′-UTR, клонировали в плазмиду, содержащую неактивный промотор T7 (dT7). Матрица транскрипции мРНК была создана с помощью ПЦР с использованием праймера для установки правильной последовательности промотора Т7 и обратного праймера, который устанавливал поли-А-хвост. мРНК получали с использованием набора HiScribe T7 High-Yield RNA Kit (New England Biolabs) в соответствии с инструкциями производителя, за исключением того, что N1-метилпсевдоуридинтрифосфат (Trilink) был заменен на уридинтрифосфат, а CleanCapAG (Trilink) был добавлен для обеспечения ко- транскрипционное кэпирование. Полученную мРНК очищали путем осаждения хлоридом лития и восстанавливали в буфере ТЕ (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0 при 25 °С). Последовательности пегРНК и sgРНК, используемые в этом исследовании, можно найти в дополнительной таблице 1. Список мотивов структурированной РНК, исследованных в этом исследовании, можно найти в дополнительной таблице 2.

Общие условия культивирования клеток млекопитающих.

Клетки HEK293T (ATCC CRL-3216), U2OS (ATCC HTB-96), K562 (CCL-243) и HeLa (CCL-2) были приобретены в ATCC, культивированы и пассированы в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением с GlutaMax (Thermo Fisher Scientific), McCoy’s 5A Medium (Gibco), RPMI Medium 1640 plus GlutaMAX (Gibco) или Eagle’s Minimal Essential Medium (EMEM, ATCC) соответственно, каждая из которых дополнена 10% (об./об.) эмбриональной телячьей сыворотки (Гибко, квалифицированный). Клетки фибробластов пациентов с первичной болезнью Тея-Сакса были получены из Института Кориелла (кат. ID GM00221) и выращены в среде DMEM с низким содержанием глюкозы (Sigma Aldrich) и 10% (об./об.) FBS с добавлением дополнительных 2 мМ L-глутамина ( Термо Фишер Сайентифик). Все типы клеток инкубировали, поддерживали и культивировали при 37 °C с 5% CO ₂ . Каждая клеточная линия была аутентифицирована соответствующим поставщиком и дала отрицательный результат на микоплазму.

Протоколы трансфекции культур тканей и нуклеофекции и подготовка геномной ДНК.

Для трансфекции 10 000 клеток HEK293T высевали на лунку 96-луночных планшетов (Corning). Через 16–24 часа после посева клетки трансфицировали примерно при 60% конфлюэнтности 0,5 мкл липофектамина 2000 (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколами производителя и 200 нг плазмиды PE, 40 нг плазмиды pegRNA и 13 нг sgRNA. плазмида (для PE3). При трансфекции уменьшенных количеств плазмид, кодируемых редактором, 0,5 мкл липофектамина 2000 использовали для трансфекции 20 нг плазмиды PE, 4 нг плазмиды pegRNA, 1,3 нг плазмиды sgRNA (для PE3) и 228 нг pUC19..

Для нуклеофекции клетки HEK293T подвергали электропорации с in vitro транскрибированной мРНК и синтетической пегРНК с использованием Lonza 4D Nucleofector с набором для клеточной линии SF (Lonza). 200 000 клеток на электропорацию центрифугировали в течение 8 мин при 120 x g, затем промывали 1 мл PBS (Thermo Fisher Scientific). После второго центрифугирования клетки ресуспендировали в 5 мкл восстановленного буфера SF на образец и добавляли в микрокюветы.

На каждую кювету по 17 мкл грузовой смеси (1 мкг мРНК PE2 в 0,5 мкл, 9Добавляли 0 пмоль пегРНК в 0,9 мкл и 60 пмоль никирующей sgРНК в 0,6 мкл и 15 мкл восстановленного буфера SF) и трижды пипетировали вверх и вниз для перемешивания. Клетки электропорировали по программе СМ-130, затем добавляли 80 мкл теплой среды и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Затем смесь пипетировали для перемешивания и добавляли 25 мкл в лунку 48-луночного планшета с конечным объемом культуры 250 мкл на лунку. Для экспериментов на клетках HeLa, U2OS и K562 800 нг PE2-экспрессирующей плазмиды, 200 нг плазмиды, экспрессирующей pegRNA, и 83 нг никирующей sgRNA-экспрессирующей плазмиды подвергали нуклеофекции в конечном объеме 20 мкл в 16-луночной полоске nucleovette ( Лонца). Клетки HeLa подвергали нуклеофекции с использованием набора SE Cell Line 4D-Nucleofector X (Lonza) с 2 × 10 ⁵ клеток на образец (программа CN-114), согласно протоколу производителя. Клетки U2OS подвергали нуклеофекции с использованием набора SE Cell Line 4D-Nucleofector X (Lonza) с 2 × 10 ⁵ клеток на образец (программа DN-100) в соответствии с протоколом производителя. Клетки K562 подвергали нуклеофекции с использованием набора SE Cell Line 4D-Nucleofector X (Lonza) с 2 × 10 ⁵ клеток на образец (программа FF-120) в соответствии с протоколом производителя.

Фибробласты, полученные от пациентов, подвергали электропорации с мРНК, кодирующей PE2, и синтетической пегРНК, а также надрезом sgRNA, как описано выше для HEK29.Клетки 3T с использованием набора для клеточной линии SE и 100 000 клеток, которые центрифугировали при 100 x g в течение 10 мин. Кроме того, в 48-луночный планшет добавляли 40 мкл восстановленных клеток вместо 25. Во всех случаях клетки культивировали через 3 дня после трансфекции, после чего среду удаляли и клетки промывали PBS (pH 7,4 при 23 °C). ) и затем лизировали добавлением 50 мкл для 96-луночных планшетов или 150 мкл для 48-луночных планшетов свежеприготовленного буфера для лизиса (10 мМ трис-HCl, pH 8 при 23 °C; 0,05% SDS; 25 мкг мл ^-1 Proteinase K (Qiagen)), и инкубацию при 37 °C в течение 1 часа или более, после чего протеиназу K инактивировали в течение 30 минут при 80 °C. Полученную гДНК хранили при температуре -20 °C до использования.

Получение и трансдукция лентивируса.

Лентивирусные плазмиды для переноса были разработаны таким образом, чтобы содержать пегРНК или эпегРНК при экспрессии с промотора U6 человека и маркер PuroR–T2A–BFP при экспрессии с основного промотора EF1α. Для упаковки лентивируса клетки HEK293T высевали на 6-луночные планшеты (Corning) при 7×10 ⁵ клеток на лунку в среде DMEM с добавлением 10% FBS. При 60% слиянии через 16 часов после посева клетки трансфицировали 12 мкл липофектамина 2000 (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколом производителя и 1,33 мкг лентивирусной переносной плазмиды, 0,67 мкг pMD2. G (Addgene #12259) и 1 мкг psPAX2 ( Addgen #12260). Через 6 часов после трансфекции среду заменяли средой DMEM с добавлением 10% FBS. Через 48 часов после трансфекции супернатант вируса центрифугировали при 3000× g в течение 15 минут для удаления клеточного дебриса, фильтровали через фильтр 0,45 мкм PVDF (Corning) и хранили при –80 °C.

Для трансдукции клеток пегРНК или эпегРНК 2 × 10 ^{6 ​​} клеток HEK293T инфицировали 20 мкл лентивируса в среде DMEM с добавлением 10% FBS и 8 мкг/мл полибрена (Sigma-Aldrich) и центрифугировали при 1000 × g в течение 2 часов при 33 °C. Через 24 часа после трансдукции клетки пассировали в DMEM с добавлением 10% FBS и 2 мкг/мл пуромицина (Thermo Fisher Scientific) для начала селекции. Флуоресценцию BFP контролировали с помощью проточного цитометра CytoFLEX S (Beckman Couolter), чтобы гарантировать множественность заражения 0,2. Через 4 дня селекции пуромицином трансдуцировали HEK29.Клетки 3T высевали на 96-луночные планшеты (Corning) в количестве 1,6×10 ⁴ клеток на лунку в среде DMEM с добавлением 10% FBS. Через 20 часов после посева клетки трансфицировали при 60-80% слиянии 200 нг плазмиды pCMV-PE2 и 0,5 мкл липофектамина 2000 (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколом производителя. Для экстракции геномной ДНК через 120 часов после трансфекции клетки промывали PBS (pH 7,4 при 23 °C) и лизировали в 10 мМ Tris-HCl, pH 8,0 при 23 °C; 0,05% ДСН; 800 единиц/мкл протеиназы К (New England BioLabs) при 37°С в течение 1,5 ч с последующей инактивацией фермента при 80°С в течение 30 мин.

Высокопроизводительное секвенирование образцов геномной ДНК.

Интересующие геномные сайты были амплифицированы из образцов геномной ДНК и секвенированы на Illumina MiSeq, как описано ранее ¹⁴ . Нецелевые сайты Cas9 для HEK3 , EMX1 и FANCF ранее были идентифицированы с помощью Guide-Seq ²⁸ . Праймеры, используемые для амплификации геномной ДНК клеток млекопитающих, перечислены в дополнительной таблице 3, а ампликоны перечислены в дополнительной таблице 4. Считывания секвенирования демультиплексировали с использованием MiSeq Reporter (Illumina). Выравнивание последовательностей ампликонов с эталонной последовательностью выполняли с использованием CRISPResso2 (ссылка 54). Для всех количественных оценок эффективности простого редактирования эффективность редактирования рассчитывалась как процент чтений с желаемым редактированием без вставок от общего числа чтений со средней оценкой phred не менее тридцати. Для количественной оценки редактирования точечных мутаций CRISPResso2 запускали в стандартном режиме с включенным «discard_indel_reads». Выход редактирования рассчитывался как процент неотброшенных прочтений, содержащих редактирование, деленный на общее количество прочтений. Для редактирования вставки или удаления CRISPResso2 запускался в режиме HDR, используя желаемый аллель в качестве ожидаемого аллеля и с включенным «discard_indel_reads». Эффективность редактирования рассчитывалась как процентное соотношение чтений, выровненных по HDR, к общему количеству чтений. Для всех экспериментов частота инделей рассчитывалась как количество отброшенных прочтений, деленное на общее количество прочтений. Для экспериментов с участием PE2 чтения анализировали на наличие инделей в пределах 10 нуклеотидов вверх и вниз по течению от ник-сайта пегРНК включительно. Для экспериментов с участием PE3 чтения анализировали на наличие вставок между 10 нуклеотидами выше ник-сайта пегРНК и ниже ник-сайта sgRNA включительно. Нецелевое редактирование определяли количественно, как описано ранее ¹⁴ .

RTqPCR тотальной РНК.

10 000 клеток HEK293T на лунку высевали в 96-луночные планшеты. Через 16–24 часа после посева клетки трансфицировали примерно при 60% конфлюэнтности 0,5 мкл липофектамина 2000, 200 нг плазмиды PE2 и 40 нг плазмиды пегРНК или эпеРНК в соответствии с протоколами производителя. Через три дня тотальную РНК выделяли с помощью универсального набора AllPrep DNA/RNA/miRNA (Qiagen). Набор Power SYBR Green Cells-to-C _T (Thermo Fisher Scientific) использовали для создания кДНК с использованием случайных гексамеров и для проведения количественной ПЦР с прямыми и обратными праймерами, которые амплифицируют каркас пегРНК в соответствии с протоколами производителя. Последовательности праймеров доступны в дополнительной таблице 5.

Анализы чувствительности к экзонуклеазам in vitro.

пегРНК или эпегРНК, содержащие либо mpknot, либо evopreQ ₁ , были получены с использованием набора для синтеза РНК HiScribe T7 Quick High Yield RNA (New England BioLabs) из ПЦР-амплифицированных матриц, содержащих последовательность промотора Т7, в соответствии с протоколами производителя с последующей очисткой с помощью Monarch Набор для очистки РНК (New England BioLabs). Ядерные экстракты были приготовлены из 3 миллионов клеток HEK293T, выращенных до 70–80% слияния в соответствии с протоколами производителя, с использованием набора EpiQuik Nuclear Extraction Kit (EpiGentek). Анализы проводили в реакционных смесях объемом 10 мкл, содержащих 20 мМ трис-HCl (pH 7,5 при 23 °C), 5 мМ MgCl ₂ , 50 мМ NaCl, 2 мМ DTT, 1 мМ NTP и 0,8 ед/мкл рекомбинантного ингибитора рибонуклеазы RNaseOUT (40 ед/мкл; ThermoFisher Scientific) для ингибирования эндонуклеазной активности. 3 мкл свежего ядерного лизата использовали для деградации 0,5 мкг РНК-субстрата на реакцию. После инкубации реакционных смесей при 37 °С в течение 20 мин продукты деградации разделяли на 2,0% агарозных гелях, окрашенных SYBR Gold. Степень деградации определяли с использованием программного обеспечения ImageJ (NIH). Чтобы определить, является ли Cas9мог защитить каркас sgRNA от деградации экзонуклеазами, 1 нМ пегРНК или эпигРНК инкубировали в присутствии или в отсутствие 100 нМ nCas9 при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы обеспечить связывание nCas9-H840A с пегРНК. Анализы деградации проводили в 10 мкл реакционных смесей, содержащих 20 мМ Tris-HCl (pH 7,5 при 23 °C), 5 мМ MgCl ₂ , 50 мМ NaCl, 2 мМ DTT, 1 мМ dNTP и 0,8 U/ мкл ингибитора рекомбинантной рибонуклеазы RNaseOUT. 3 мкл свежего ядерного лизата использовали для деградации Cas9.никазо-связанная пегРНК или эпегРНК. После инкубации реакционных смесей при 37°С в течение 10 мин к реакционной смеси добавляли 1 мкл раствора протеазы К (Qiagen) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин для инактивации нуклеаз. Всю оставшуюся РНК выделяли с использованием набора Monarch RNA Cleanup Kit (New England Biolabs) для анализа с помощью RT-qPCR.

Обнаружение pegRNAs и epegRNAs в клеточных лизатах с помощью нозерн-блоттинга.

Клетки HEK293T трансфицировали плазмидами, кодирующими PE2 и pegRNA или epegRNA, как описано выше. Клетки лизировали через 3 дня и выделяли общую РНК с использованием универсального набора AllPrep DNA/RNA/miRNA (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Количество мРНК PE2 определяли с помощью RT-qPCR, и это значение использовали для нормализации лизатов до той же концентрации мРНК PE2. Лизаты разделяли с помощью PAGE с использованием 10% денатурирующего геля PAGE (Criterion, Biorad). Лестницу оцРНК метили с 3′-конца дигоксигенин-ddUTP с использованием терминальной трансферазы (набор для мечения 3′-конца олигонуклеотидов DIG, Roche) и использовали в качестве маркера. Другими используемыми маркерами были пегРНК, транскрибированная in vitro, и матрица эпигРНК при +1 вставке тега FLAG в HEK3 и HEK293T клеточные лизаты, содержащие HEK3 , нацеленную на sgRNA. Перенос и перекрестное связывание РНК с мембраной нозерн-блоттинга в основном следовали ранее описанным процедурам обнаружения малых РНК ⁵⁵ . РНК переносили на положительно заряженную нейлоновую мембрану (Roche) с использованием полусухого геля Trans-Blot SD при 20 В в течение 1 часа (1–3 мА/см ² ). Затем РНК сшивали с мембраной путем замачивания в водном растворе 0,162 М EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, Sigma Aldrich) и 0,17 М 1-метилимидазола (Sigma Aldrich, pH 8,0 при 23 °C). ) при 60°С в течение 1 часа. Блоты несколько раз кратко промывали водой, обработанной DEPC, а затем предварительно гибридизовали в гибридизационном буфере Ultrahyb (набор northern Max, Thermo Fisher) при 68 °C в течение 2 часов. Зонд РНК, комплементарный 64 нуклеотидам каркаса sgRNA (дополнительная таблица 5), был создан и помечен телом с помощью дигоксигенина-UTP посредством транскрипции in vitro с T7 и с использованием стартового набора DIG Northern (Roche). 5 пмоль меченого зонда добавляли к 0,5 мл буфера Ultrahyb и инкубировали в течение 5 мин при 70°C, а затем добавляли к предварительно гибридизованному блоту при 68°C. Гибридизацию оставляли на ночь. Затем блоты дважды промывали в промывочном растворе с низкой жесткостью (набор northernMax, эквивалентный 2x SSC и 0,1% SDS) в течение 5 минут при комнатной температуре и дважды в промывочном растворе с высокой жесткостью (набор northernMax, эквивалентный 0,1x SSC и 0,1% SDS). в течение 15 мин при 68°С. Затем блоты промывали промывочным буфером (0,1 М малеиновая кислота, 0,15 М NaCl, 0,3% (об./об.) Tween 20, pH 7,5 при 23 °C) в течение 5 мин при комнатной температуре, а затем инкубировали в блокирующем буфере (DIG Northern Starter). комплект) в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем блоты инкубировали в блокирующем буфере с добавлением антитела против дигоксигенина-AP (DIG Northern Starter Kit) в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем дважды промывали промывочным буфером в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем блоты уравновешивали буфером для обнаружения (0,1 М трис-HCl, 0,1 М NaCl, pH 9)..5 23 °C) в течение 5 мин перед удалением в папку для разработки. Затем к блоту по каплям добавляли CDP- Star , блот накрывали и инкубировали при комнатной температуре от 5 минут до ночи перед визуализацией с помощью Biorad ChemiDoc MP. Уровни pegRNA и epegRNA определяли денситометрией с использованием ImageJ.

Анализ связывания epegRNA.

Микромасштабный термофорез (MST) был проведен с использованием Monolith NT.Automated (Nanotemper) с капиллярами с первоклассным покрытием для определения Cas9.аффинности связывания с pegRNAs и epegRNAs или с dsDNA в комплексе с pegRNAs или epegRNAs. Реакции связывания проводили при 25 °C в 20 мкл буфера HBS-P (10 мМ HEPES, pH 7,4 при 23 °C, 150 мМ NaCl, 0,05% по объему поверхностно-активного вещества P20), содержащего 1 мМ MgCl ₂ . Концентрация Mg ²⁺ была выбрана так, чтобы имитировать расчетную концентрацию свободного Mg ²⁺ в клетках человека ⁵⁶ . Для экспериментов по связыванию РНК РНК транскрибировали in vitro , как описано ранее, и 3′-метилировали с помощью pCp-Cy5 (Jena Bioscience) с использованием РНК-лигазы T4 1 (New England BioLabs) в соответствии с протоколами производителя, модифицированными для включения 10 мкМ pCp-Cy5. Cy5 с последующей очисткой с помощью набора Monarch RNA Cleanup (New England BioLabs). 1 нМ Cy5-меченую РНК денатурировали в течение 3 минут при 72 °C, выдерживали на льду в течение 1 минуты, а затем инкубировали с SpCas9.-H840A (Integrated DNA Technologies) в течение 30 минут при 25 °C перед анализом MST. Для экспериментов по связыванию двухцепочечной ДНК субстрат двухцепочечной ДНК собирали путем медленного отжига Cy5-меченого обратного олигонуклеотида и немеченого прямого олигонуклеотида, соответствующего геномному локусу HEK3 (дополнительная таблица 5). RNP Cas9 получали путем инкубации dSpCas9 (Integrated DNA Technologies) в течение 30 минут при 25 °C в буфере HBS-P с 1 мМ MgCl ₂ и 50-кратным молярным избытком немеченой пегРНК или эпегРНК для поддержания насыщенных условий связывания РНК. Cas9Затем RNP инкубировали с 1 нМ субстрата двухцепочечной ДНК, меченной Cy5, в течение 30 минут при 25 ° C перед анализом MST. Cy5 демонстрирует существенное изменение интенсивности, связанное с температурой (TRIC), что обеспечивает достаточное усиление сигнала для обнаружения взаимодействий белок / пегРНК или двухцепочечной ДНК / РНП. Как правило, энергия лазерного возбуждения была установлена ​​на 20 %, а мощность ИК-лазера была установлена ​​на высокую для всех показаний. Все измерения были выполнены в трех повторностях, причем серия разведений для каждой повторности проводилась отдельно, с использованием серийных разведений либо dSpCas9, либо dSpCas9.или SpCas9-H840A от 100 нМ до 0 нМ. Данные были проанализированы в Prism 9 путем выполнения логистической регрессии по логарифму ([белок]) и изменению сигнала с точкой данных концентрации 0 нМ, установленной на 0,1 нМ для целей регрессии.

Активация транскрипции на основе Cas9.

10 000 клеток HEK293T на лунку высевали в 96-луночные планшеты с черными стенками (Corning). Через 16–24 часа после посева клетки трансфицировали примерно при 60% конфлюэнтности 0,5 мкл липофектамина 2000 в соответствии с протоколами производителя и 100 нг dCas9.– плазмида VPR, 30 нг репортерной плазмиды GFP, 15 нг плазмиды iRFP и 20 нг плазмиды sgRNA, pegRNA или epegRNA. Через три дня клетки измеряли на предмет флуоресценции GFP и iRFP с использованием устройства для считывания микропланшетов Infinite M1000 Pro (Tecan). Флуоресценцию GFP нормализовали по флуоресценции iRFP после вычитания фонового сигнала флуоресценции от необработанных клеток.

Анализ терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы.

10 000 клеток HEK293T на лунку высевали в 96-луночные планшеты. Через 16–24 часа после посева клетки трансфицировали примерно при 60% конфлюэнтности 0,5 мкл липофектамина 2000 в соответствии с протоколами производителя и 200 нг плазмиды PE2 и 40 нг плазмиды пегРНК или эпеРНК. Через 24 часа из клеток выделяли геномную ДНК с помощью набора Agencourt DNAdvance (Beckman Coulter) в соответствии с инструкциями производителя. 3′-концы были присоединены к гуанозину с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (New England Biolabs) в соответствии с инструкциями производителя. Затем образцы снова очищали с использованием набора Agencourt DNAdvance перед ПЦР-амплификацией для высокопроизводительного секвенирования ДНК с использованием локус-специфического прямого праймера и олиго-C (C ₁₈ ) обратная грунтовка. Последовательности праймеров доступны в дополнительной таблице 5. Промежуточные продукты первичного редактирования были количественно определены с использованием пользовательского сценария Python, доступного в дополнительном примечании 3.

Дизайн линкера с помощью pegLIT.

Для разработки линкерных последовательностей эпигРНК мы написали специальный алгоритм, инструмент идентификации линкера пегРНК или pegLIT, который ищет линкерные последовательности заданной длины, минимизирующие спаривание оснований с остальной частью пегРНК. Чтобы сократить время вычислений, в этой процедуре используется имитация отжига для максимизации подоценок ⁵⁷ , каждая из которых соответствует подпоследовательности пегРНК: спейсер, PBS, матрица или скаффолд. Соответственно, разные линкерные последовательности могут быть созданы для одной и той же эпигРНК, если алгоритм выполняется несколько раз. Во время оптимизации линкер с более высокой оценкой в ​​любой паре линкеров определялся путем сравнения их дискретизированных подпоказателей в порядке следующего приоритета подпоследовательности: спейсер, PBS, шаблон и затем каркас. Каждая подшкала рассчитывается с использованием вероятностей пар оснований, рассчитанных программой ViennaRNA 2.0 (ссылка 23) при стандартных параметрах (37 °C, 1 М NaCl, 0,05 М MgCl 9 ).0329 2 ), как дополнение средней вероятности того, что нуклеотид в линкере образует пару оснований с любым нуклеотидом в рассматриваемой подпоследовательности пегРНК, где среднее значение берется по всем основаниям в линкере. Линкерные последовательности с содержанием AC < 50% и те, которые приводят к pegRNA, содержащей последовательно четыре одинаковых нуклеотида, удаляются из рассмотрения ^39,58 . При необходимости алгоритм выполняет иерархическую агломеративную кластеризацию 100 линкеров с наивысшей оценкой и выводит по одному линкеру на кластер, чтобы способствовать разнообразию последовательностей в конечном результате. Наша реализация pegLIT на Python общедоступна на liugroup.us, а код можно найти в дополнительном примечании 2 или на github.com/sshen8/peglit.

Доступность данных

Данные высокопроизводительного секвенирования депонированы в базу данных NCBI Sequence Read Archive по адресу PRJNA707486. Плазмиды, кодирующие выбранные векторы экспрессии pegRNA и векторы клонирования Golden Gate, были депонированы в Addgene для распространения.

Доступность кода

Реализация pegLIT на Python общедоступна на peglit.liugroup.us, а код можно найти в дополнительном примечании 2 или на github.com/sshen8/peglit.

Полный СИ

Нажмите здесь для просмотра. ^{(6.5M, pdf)}

Вкладка Sup

Щелкните здесь для просмотра. ^{(123K, xlsx)}

Эта работа была поддержана NIH США U01Al142756, RM1HG009490, R01EB031172 и R35GM118062, Медицинским институтом Говарда Хьюза и Фондом Лулу. Дж.В.Н. и А.В.А. были поддержаны постдокторскими стипендиями Джейн Коффин Чайлдс, PBR, SPS, KAE и PJC. были поддержаны стипендиями выпускников NSF, G.A.N. был поддержан постдокторской стипендией Хелен Хэй Уитни. Мы благодарим доктора Анахиту Виейру за помощь в редактировании этой рукописи, Мэри О’Рейли, Елену Берг и команду Broad Institute Pattern за помощь в разработке рисунка, Шона МакГрири и Кехуи Сян за полезные обсуждения процедур нозерн-блоттинга и Макса Шена за полезные обсуждения. по кодированию pegLIT.

Конкурирующие интересы

Авторы являются соавторами патентов, поданных Институтом Броуда на основное редактирование. Д.Р.Л. является консультантом и соучредителем компаний Prime Medicine, Beam Therapeutics и Pairwise Plants, которые используют редактирование генома. А.В.А. в настоящее время является сотрудником Prime Medicine.

Дополнительная информация Дополнительное обсуждение, дополнительные рисунки 1–16, дополнительные таблицы 1–6, дополнительные примечания 1–3

1. Komor AC, Badran AH & Liu DR Технологии на основе CRISPR для манипулирования геномами эукариот. Клетка 168, 20–36 (2017). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

2. Анзалоне А.В., Коблан Л.В. и Лю Д.Р. Редактирование генома с помощью нуклеаз CRISPR-Cas, базовых редакторов, транспозаз и основных редакторов. Нат Биотехнолог 38, 824–844 (2020). [PubMed] [Google Scholar]

3. Калло Г. и другие. Редактирование генома CRISPR-Cas9 вызывает усечение хромосом в масштабе мегабаз. Нац Коммуна 10, 1136 (2019). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

4. Косицки М., Томберг К. и Брэдли А. Репарация двухцепочечных разрывов, индуцированная CRISPR-Cas9, приводит к большим делециям и сложным перестройкам. Нат Биотехнолог 36, 765–771 (2018). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

5. Боровяк К., Фу Б., Ян Ф., Доу Б. и Брэдли А. Выявление скрытых сложностей геномных перестроек, созданных с помощью Cas9. научный представитель 7, 12867 (2017). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

6. Enache OM и другие. Cas9 активирует путь р53 и выбирает мутации, инактивирующие р53. Нат Жене 52, 662–668 (2020). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

7. Хаапаниеми Э., Ботла С., Перссон Дж., Шмирер Б. и Тайпале Дж. Редактирование генома CRISPR-Cas9 вызывает реакцию повреждения ДНК, опосредованную p53. Нат Мед 24, 927–930 (2018). [PubMed] [Google Scholar]

8. Игорь Р.Дж. и другие. p53 ингибирует инженерию CRISPR-Cas9 в плюрипотентных стволовых клетках человека. Нат Мед 24, 939–946 (2018). [PubMed] [Google Scholar]

9. Лейбовиц М.Л. и другие. Хромотрипсис как целевое следствие редактирования генома CRISPR-Cas9. Нат Жене 10.1038/s41588-021-00838-7 (2021). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

10. Burgio G & Teboul L Предвидение и выявление побочного ущерба при редактировании генома. Тенденции Жене 36, 905–914 (2020). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

11. Cox DB, Platt RJ & Zhang F Терапевтическое редактирование генома: перспективы и проблемы. Нат Мед 21, 121–131 (2015). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

12. Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA & Liu DR Программируемое редактирование целевого основания в геномной ДНК без расщепления двухцепочечной ДНК. Природа 533, 420–424 (2016). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

13. Gaudelli NM и другие. Программируемое редактирование оснований от A*T до G*C в геномной ДНК без расщепления ДНК. Природа 551, 464–471 (2017). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

14. Анзалон А.В. и другие. Редактирование генома с помощью поиска и замены без двухцепочечных разрывов или донорской ДНК. Природа 576, 149–157 (2019). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

15. Houseley J & Tollervey D Множество путей деградации РНК. Клетка 136, 763–776 (2009). [PubMed] [Google Scholar]

16. Хендель А. и другие. Химически модифицированные направляющие РНК улучшают редактирование генома CRISPR-Cas в первичных клетках человека. Нат Биотехнолог 33, 985–989 (2015). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

17. Geisberg JV, Moqtaderi Z, Fan X, Ozsolak F & Struhl K Общий анализ периодов полураспада изоформ мРНК выявляет стабилизирующие и дестабилизирующие элементы в дрожжах. Клетка 156, 812–824 (2014). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

18. Wu X & Bartel DP Широко распространенное влияние 3′-концевых структур на процессинг и стабильность мРНК млекопитающих. Клетка 169, 905–917 e911 (2017). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

19. Браун Дж. А. и другие. Структурное понимание стабилизации некодирующей РНК MALAT1 с помощью двойной тройной спирали. Nat Struct Мол Биол 21, 633–640 (2014). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

20. Рот А. и другие. Рибопереключатель, селективный в отношении предшественника кеуозина preQ1, содержит необычно маленький аптамерный домен. Nat Struct Мол Биол 14, 308–317 (2007). [PubMed] [Google Scholar]

21. Анзалоне А.В., Лин А.Дж., Заирис С., Рабадан Р. и Корниш В.В. Перепрограммирование эукариотической трансляции с помощью лиганд-чувствительных синтетических РНК-переключателей. Нат Методы 13, 453–458 (2016). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

22. Houck-Loomis B и другие. Зависимый от равновесия ретровирусный переключатель мРНК регулирует трансляционную запись. Природа 480, 561–564 (2011). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

23. Лоренц Р. и другие. Пакет ViennaRNA 2.0. Алгоритмы Мол Биол 6, 26 (2011). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

24. Schene IF и другие. Основное редактирование для функционального восстановления в моделях заболеваний, полученных от пациентов. Нац Коммуна 11, 5352 (2020). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

25. Kim DY, Moon SB, Ko JH, Kim YS и Kim D Беспристрастное исследование особенностей основных систем редактирования в клетках человека. Нуклеиновые Кислоты Res 48, 10576–10589 (2020). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

26. Гао П. и другие. Прайм-редактирование у мышей показывает важность одного основания в управлении экспрессией тканеспецифического гена. Геном Биол 22, 83 (2020). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

27. Lin Q, et al. Высокоэффективное первичное редактирование с оптимизированными парными пегРНК в растениях. Нат Биотехнолог (2021). 10.1038/s41587-021-00868-w. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

28. Tsai SQ и другие. GUIDE-seq обеспечивает полногеномное профилирование нецелевого расщепления нуклеазами CRISPR-Cas. Нат Биотехнолог 33, 187–197 (2015). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

29. Schmid M & Jensen TH Экзосома: многоцелевая машина для распада РНК. Тенденции биохимии 33, 501–510 (2008). [PubMed] [Google Scholar]

30. Ибрагим Х., Вилуш Дж. и Вилуш С.Дж. Распознавание РНК экзонуклеазами с 3′-на 5′: взгляд с субстрата. Биохим биофиз акта 1779, 256–265 (2008). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

31. Green L, Kim CH, Bustamante C & Tinoco I Jr. Характеристика механического развертывания псевдоузлов РНК. Джей Мол Биол 375, 511–528 (2008). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

32. Чавес А. и другие. Высокоэффективное Cas9-опосредованное программирование транскрипции. Нат Методы 12, 326–328 (2015). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

33. Hu JH и другие. Разработанные варианты Cas9 с широкой совместимостью с PAM и высокой специфичностью ДНК. Природа 556, 57–63 (2018). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

34. Nahar S и другие. Мотив G-квадруплекса на 3′-конце sgRNA повышает эффективность редактирования генома на основе CRISPR-Cas9. Химическая коммуна 54, 2377–2380 (2018). [PubMed] [Академия Google]

35. Штекельберг А.Л. и другие. Свернутая вирусная некодирующая РНК блокирует экзорибонуклеазы клетки-хозяина через конформационно-динамическую структуру РНК. Proc Natl Acad Sci USA 115, 6404–6409 (2018). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

36. Cate JH и другие. Кристаллическая структура рибозимного домена группы I: принципы упаковки РНК. Наука 273, 1678–1685 (1996). [PubMed] [Google Scholar]

37. Федор М.Ю. и Вестхоф Э. Рибозимы: первые 20 лет. Мол Ячейка 10, 703–704 (2002). [PubMed] [Академия Google]

38. Чен Б. и другие. Динамическая визуализация геномных локусов в живых клетках человека с помощью оптимизированной системы CRISPR/Cas. Клетка 155, 1479–1491 (2014). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

39. Йост М. и другие. Титрование экспрессии генов с использованием библиотек систематически аттенуированных направляющих РНК CRISPR. Нат Биотехнолог 38, 355–364 (2020). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

40. Basila M, Kelley ML & Smith AVB Минимальная схема модификации 2′-O-метилфосфотиоатной связи синтетических направляющих РНК для повышения стабильности и эффективности CRISPR-Cas9редактирование генов во избежание клеточной токсичности. PLoS Один 12, e0188593 (2017). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

41. Мид С. и другие. Новый вариант защитного прионного белка, который колокализуется при воздействии куру. N Engl J Med 361, 2056–2065 (2009). [PubMed] [Google Scholar]

42. Asante EA и другие. Встречающийся в природе вариант человеческого прионного белка полностью предотвращает прионные заболевания. Природа 522, 478–481 (2015). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

43. Kim HK и другие. Прогнозирование эффективности основных направляющих РНК для редактирования в клетках человека. Нат Биотехнолог (2020). [PubMed] [Академия Google]

44. Йонссон Т. и другие. Мутация в APP защищает от болезни Альцгеймера и возрастного снижения когнитивных функций. Природа 488, 96–99 (2012). [PubMed] [Google Scholar]

45. Абифадель М. и другие. Мутации PCSK9 вызывают аутосомно-доминантную гиперхолестеринемию. Нат Жене 34, 154–156 (2003). [PubMed] [Google Scholar]

46. Бустами Дж. и другие. Белок-переносчик эфира холестерина (CETP) полиморфизм I405V и сердечно-сосудистые заболевания у восточноевропейских европеоидов — перекрестное исследование. БМС Гериатр 16, 144 (2016). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

47. Фланник Дж. и другие. Мутации с потерей функции в SLC30A8 защищают от диабета 2 типа. Нат Жене 46, 357–363 (2014). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

48. Сакунтабхай А. и другие. Вариант промотора CD209 связан с тяжестью болезни денге. Нат Жене 37, 507–513 (2005). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

49. Olson HE и другие. Циклин-зависимая киназоподобная 5-дефицитная недостаточность: клинический обзор. Педиатр Нейрол 97, 18–25 (2019). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

50. Аль-Сааиди Р. и другие. Мутация LMNA p.Arg321Ter, связанная с дилатационной кардиомиопатией, приводит к снижению экспрессии и искаженному соотношению белков ламина А и ламина С. Разрешение ячейки опыта 319, 3010–3019 (2013). [PubMed] [Google Scholar]

51. Ип JPK, Меллиос Н. и Сур М. Синдром Ретта: понимание генетических, молекулярных и схемных механизмов. Нат Рев Нейроски 19, 368–382 (2018). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

52. Христодулу Дж., Гримм А., Махер Т. и Беннеттс Б. RettBASE: база данных вариаций MECP2 IRSA — новая эволюционирующая база данных мутаций. Хум Мутат 21, 466–472 (2003). [PubMed] [Google Scholar]

53. Гауделли Н.М. и другие. Направленная эволюция редакторов оснований аденина с повышенной активностью и терапевтическим применением.

No related posts.